DNA連接酶

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更新時間: 2013-12-12

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連接酶舊稱「合成酶」。DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發現的,最初是在大腸桿菌細胞中發現的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶,藉助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外),而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。

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1 DNA連接酶 -概述

DNA連接酶DNA連接酶
連接酶舊稱「合成酶」。DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發現的,最初是在大腸桿菌細胞中發現的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶,藉助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外),而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。

2 DNA連接酶 -一般性質

DNA連接酶DNA重組

大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈。對胰蛋白酶敏感,可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應形成酶-AMP中間物,但不能繼續將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。DNA連接酶在大腸桿菌細胞中約有300個分子,和DNA聚合酶Ⅰ的分子數相近,這也是比較合理的現象。因為DNA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后封閉DNA雙鏈上的缺口。這在DNA複製、修復和重組中起著重要的作用,連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA複製、修復和重組。

噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈,分子量為60KD,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外,NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連接酶的的催化速率,而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶,還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條遊離的DNA鏈相連接。

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3 DNA連接酶 -DNA連接酶種類

4 DNA連接酶 -幾種酶的比較

DNA連接酶DNA連接
限制性核酸內切酶(以下簡稱限制酶):限制酶主要存在於微生物(細菌、黴菌等)中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,並且能在特定的切點上切割DNA分子。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶(「分子手術刀」)。發現於原核生物體內,現已分離出100多種,幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術和基因診斷中重要的一類工具酶。例如,從大腸桿菌中發現的一種限制酶只能識別GAATTC序列,並在G和A之間將這段序列切開。目前已經發現了200多種限制酶,它們的切點各不相同。蘇雲金芽孢桿菌中的抗蟲基因,就能被某種限制酶切割下來。在基因工程中起作用。
DNA連接酶:主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵,起連接作用,在基因工程中起作用。
DNA聚合酶:主要是連接DNA片段與單個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵,在DNA複製中起做用。
DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上,形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。
DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板,將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈;而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。
RNA聚合酶(又稱RNA複製酶、RNA合成酶)的催化活性:RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板,轉錄時DNA的雙鏈結構部分解開,轉錄后DNA仍然保持雙鏈的結構。真核生物RNA聚合酶:真核生物的轉錄機制要複雜得多,有三種細胞核內的RNA聚合酶:RNA聚合酶I轉錄rRNA,RNA聚合酶II轉錄mRNA,RNA聚合酶III轉錄tRNA和其它小分子RNA。在RNA複製和轉錄中起作用。
反轉錄酶:RNA指導的DNA聚合酶,具有三種酶活性,即RNA指導的DNA聚合酶,RNA酶,DNA指導的DNA聚合酶。在分子生物學技術中,作為重要的工具酶被廣泛用於建立基因文庫、獲得目的基因等工作。在基因工程中起作用。
解旋酶:是一類解開氫鍵的酶,由水解ATP來供給能量它們常常依賴於單鏈的存在,並能識別複製叉的單鏈結構。在細菌中類似的解旋酶很多,都具有ATP酶的活性。大部分的移動方向是5'→3',但也有3'→5'移到的情況,如n'蛋白在φχ174以正鏈為模板合成複製形的過程中,就是按3'→5'移動。在DNA複製中起做用。DNA限制酶作用於磷酸二酯鍵
;DNA連接酶作用於磷酸二酯鍵;DNA聚合酶作用於磷酸二酯鍵;DNA解旋酶作用於氫鍵

5 DNA連接酶 -DNA體外連接

目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段:
DNA連接酶DNA連接


第一種方法是,用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段;
第二種方法是,用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來,或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)尾巴之後,再用DNA連接酶將它們連接起來;
第三種方法是,先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭,使之形成粘性末端之後,再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法雖然互有差異,但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。

粘性末端DNA片段的連接
DNA連接酶最突出的特點是,它能夠催化外源DNA和載體分子之間發生連接作用,形成重組的DNA分子。

平末端DNA片段的連接
常用的平末端DNA片段連接法,主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法。
(1)同聚物加尾法

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這種方法的核心部分是,利用末端脫氧核苷酸轉移酶轉移核苷酸的特殊功能。末端脫氧核苷酸轉移酶是從動物組織中分離出來的一種異常的DNA聚合酶,它能夠將核苷酸(通過脫氧核苷三磷酸前體)加到DNA分子單鏈延伸末端的3′-OH基團上。由核酸外切酶處理過的DNA,以及dATP和末端脫氧核苷酸轉移酶組成的反應混合物中,DNA分子的3′-OH末端將會出現單純由腺嘌呤核苷酸組成的DNA單鏈延伸。這樣的延伸片段,稱之為poly(dA)尾巴(圖2-7)。反過來,如果在反應混合物中加入的是dTTP,那麼DNA分子的3′-OH末端將會形成poly(dT)尾巴。因此任何兩條DNA分子,只要分別獲得poly(dA)和poly(dT)尾巴,就會彼此連接起來。這種連接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴連接法(homopolymertail-joining),簡稱同聚物加尾法。

(2)銜接物連接法

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所謂銜接物(linker),是指用化學方法合成的一段由10~12個核苷酸組成、具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。銜接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端,用多核苷酸激酶處理使之磷酸化,然後再通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。接著用適當的限制酶消化具銜接物的DNA分子和克隆載體分子,這樣的結果使二者都產生出了彼此互補的粘性末端。於是我們便可以按照常規的粘性末端連接法,將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來。

(3)DNA接頭連接法

DNA接頭,是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之後,便會使後者成為具粘性末端的新的DNA分子,而易於連接重組。實際使用時對DNA接頭末端的化學結構進行必要的修飾與改造,可避免處在同一反應體系中的各個DNA接頭分子的粘性末端之間發生彼此間的配對連接。

6 DNA連接酶 -功能


限制性核酸內切酶(以下簡稱限制酶):限制酶主要存在於微生物(細菌、黴菌等)中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,並且能在特定的切點上切割DNA分子。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶(「分子手術刀」)。發現於原核生物體內,現已分離出100多種,幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術和基因診斷中重要的一類工具酶。例如,從大腸桿菌中發現的一種限制酶只能識別GAATTC序列,並在G和A之間將這段序列切開。目前已經發現了200多種限制酶,它們的切點各不相同。蘇雲金芽孢桿菌中的抗蟲基因,就能被某種限制酶切割下來。在基因工程中起作用。
DNA連接酶:主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵,起連接作用,在基因工程中起作用。基因工程中,大腸桿菌連接酶只連接黏性末端,而T4連接酶既可連接黏性末端,又可連接平末端。
DNA聚合酶:主要是連接DNA片段與單個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵,在DNA複製中起做用。
DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上,形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。
DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板,將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈;而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。

  DNA連接
RNA聚合酶(又稱RNA複製酶、RNA合成酶)的催化活性:RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板,轉錄時DNA的雙鏈結構部分解開,轉錄后DNA仍然保持雙鏈的結構。真核生物RNA聚合酶:真核生物的轉錄機制要複雜得多,有三種細胞核內的RNA聚合酶:RNA聚合酶I轉錄rRNA,RNA聚合酶II轉錄mRNA,RNA聚合酶III轉錄tRNA和其它小分子RNA。在RNA複製和轉錄中起作用。
反轉錄酶:RNA指導的DNA聚合酶,具有三種酶活性,即RNA指導的DNA聚合酶,RNA酶,DNA指導的DNA聚合酶。在分子生物學技術中,作為重要的工具酶被廣泛用於建立基因文庫、獲得目的基因等工作。在基因工程中起作用。
解旋酶:是一類解開氫鍵的酶,由水解ATP來供給能量它們常常依賴於單鏈的存在,並能識別複製叉的單鏈結構。在細菌中類似的解旋酶很多,都具有ATP酶的活性。大部分的移動方向是5'→3',但也有3'→5'移到的情況,如n'蛋白在φχ174以正鏈為模板合成複製形的過程中,就是按3'→5'移動。在DNA複製中起做用。
DNA限制酶作用於磷酸二酯鍵
DNA連接酶作用於磷酸二酯鍵
DNA聚合酶作用於磷酸二酯鍵
DNA解旋酶作用於氫鍵

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