雙向凝膠電泳

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更新時間: 2013-12-10

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雙向凝膠電泳的原理是第一向基於蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離,第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離,把複雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。

 

雙向凝膠電泳 -簡介

雙向凝膠電泳的原理是第一向基於蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離,第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離,把複雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。

分離蛋白質組所有蛋白的兩個關鍵參數是其解析度和可重複性。在目前情況下,雙向凝膠電泳的一塊膠板(16cm×20cm)可分出3~4千個,甚至1萬個可檢測的蛋白斑點,這與10萬個基因可表達的蛋白數目相比還是太少了。80年代開始採用固定化pH梯度膠,克服了載體兩性電解質陰極漂移等許多缺點而得以建立非常穩定的可以隨意精確設定的pH梯度。由於可以建立很窄的pH範圍(如0.05U/cm),對特別感興趣的區域可在較窄的pH範圍內做第二輪分析,從而大大提高了解析度。此種膠條已有商品生產,因此基本上解決了雙向凝膠電泳重複性的問題。這是雙向凝膠電泳技術上的一個非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法,可分離10~100kD分子量的蛋白質。

其中靈敏度較高的銀染色法可檢測到4ng蛋白,最靈敏的還是用同位素標記,20ppm的標記蛋白就可通過其熒光或磷光的強度而測定。用圖像掃描儀、萊賽密度儀、電荷組合裝置可把用上述方法得到的蛋白圖譜數字化,再經過計算機處理,去除縱向和橫向的曳尾以及背景底色,就可以給出所有蛋白斑點的準確位置和強度,得到布滿蛋白斑點的圖像,即所謂「參考膠圖譜」。蛋白質組研究的主要困難是對用雙向凝膠電泳分離出來的蛋白,進行定性和定量的分析。最常用的方法是先把膠上的蛋白印跡到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再進行分析,確定它們是已知還是未知蛋白。現在的分級分析法是先做快速的氨基酸組成分析,也可先做4~5個循環的N末端微量測序,再做氨基酸組成分析;結合在電泳膠板上估計的等點電和分子量,查對資料庫中已知蛋白的數據,即可作出判斷。有文獻報道,N末端4個殘基序列的數據就可以給出很多的信息而得到相當準確的結果。如再結合C末端序列,判斷結果的準確性會更高。對分離得到的蛋白質作進一步的確切鑒定需要有足夠數量的純蛋白,電泳時蛋白質已經過了高度純化。現在一塊膠板可允許上到高達mg數量級的樣品,因此每個分離的蛋白斑點可有μg數量的蛋白,這樣使本來是微量的蛋白也可希冀被鑒定。

蛋白質的翻譯后修飾和加工,是指在肽鏈合成完成後進行的化學反應,如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵形成,以及最近發現的蛋白質自剪接等等,可能有一百種以上。翻譯后修飾和加工對蛋白質的正常生理功能是必需的,它們的變化往往和疾病的發生有關。用雙向凝膠電泳可以進行翻譯后修飾的研究,如用32P標記可以研究磷酸化蛋白的變化。雙向凝膠電泳中常可發現的蛋白質拖曳現象,很可能是一個蛋白的不同翻譯后修飾產物所造成的。拖曳圖像變化在疾病診斷上可能提供重要的信息。

雙向凝膠電泳 -雙向凝膠電泳技術當前面臨的挑戰

(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調節蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外,最有希望的還是把介質輔助的激光解吸/離子化質譜用到PVDF膜上,但當前的技術還不足以檢出拷貝數低於1000的蛋白質。(2)極酸或極鹼蛋白的分離。(3)極大(>200kD)或極小(<10kD=蛋白的分離。(4)難溶蛋白的檢測,這類蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高質量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術,因此迫切需要自動二維電泳儀的出現。

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