柯斯質粒載體

標籤: 暫無標籤

138

更新時間: 2013-12-12

廣告

柯斯質粒載體是由collins和hohn改建的用正常的質粒與噬菌體λ的cos位點構成的一種新型大腸桿菌克隆載體。

柯斯質粒載體 -簡介
柯斯質粒載體柯斯質粒載體

 柯斯質粒是一類由人工構建的含有λ DNA的 cos序列和質粒複製子的特殊類型的質粒載體。諸如右圖所示的柯斯質粒載體pHC79,就是由λ DNΑ片段和 pBR322質粒DNA聯合組成的。一般長度4~6kb。含有Amp和Tet選擇標記基因。其上的cos位點可識別噬菌體外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度上相當於噬菌體的基因組,就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此,插入柯斯質粒載體的外源DNA片段的長度可大於40kb,從而大大增加了載體的攜帶能力。  

柯斯質粒載體 -來源

1978年由collins和hohn改建的一種新型大腸桿菌克隆載體,用正常的質粒與噬菌體λ的cos位點構成。「cosmld」一詞是由英文「cos site-carrying plasmid」縮寫而成的,其原意是指帶有粘性末端位點(cos)的質粒。

廣告

柯斯質粒載體 -特點

第一,具有λ噬菌體的特性。柯斯質粒載體在克隆了合適長度的外源DNA,並在體外被包裝成噬菌體顆粒之後,可以高效地轉導對λ噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。   

第二,具有質粒載體的持性。柯斯質粒載體具有質粒複製子,因此在寄主細胞內能夠像質粒DNA一樣進行複製,並且在氯黴素作用下,同樣也會獲得進一步的擴增。此外,柯斯質粒載體通常也都具有抗菌素抗性基因,可供作重組體分子表型選擇標記。   

第三,具有高容量的克隆能力。柯斯質粒載體的分子僅具有一個複製起點,一兩個選擇記號和COS位點等三個組成部分,其分子量較小,一般只有5~7kb左右。因此,柯斯質粒載體的克隆極限可達45kb左右。   

第四,具有與同源序列的質粒進行重組的能力。一旦柯斯質粒與一種帶有同源序列的質粒共存在同一個寄主細胞當中時,它們之間便會形成共合體。

柯斯質粒載體 -克隆應用

應用柯斯質粒載體,在大腸桿菌細胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術,叫做「柯斯克隆」(Cosmid cloning)。這種技術的理論依據是,在線性λ噬菌體DNΑ分子的每一端,都具有一段彼此互補的單鏈突出序列,即所謂的粘性末端(cos位點)。在λ噬菌體的正常生命周期中,會產生出由數百個λDNA拷貝組成的多連體分子。在此種分子中,前後兩個λDNA基因組之間都是通過cos位點連接起來的。λ噬菌體具有的一種位點特異的切割體系(site-specific cutting system),叫做末端酶(terminase)或Ter體系,能識別兩個相距適宜的cos位點,將多連體分子切割成λ單位長度的片段,並將它們包裝到λ噬菌體頭部中去。只有在被作用的λDNA分子具有兩個cos位點,而且它們之間的距離保持在38~54kb的條件下,Ter體系才能對它們發生作用。   應用柯斯質粒作載體進行基因克隆的一般程序是:將外源DNA片段與柯斯質粒線性DNA分子進行體外連接反應。由此形成的連接產物群體中,有一定比例的分子是兩端各有一個cos位點的長度為40kb左右的真核DNA片段,而且這兩個cos位點在取向上是一樣的,可作為λ噬菌體Ter功能的一種適用底物。當加入λ噬菌體的包裝連接物時,它能把這些分子包裝進λ噬菌體的頭部,可以用來感染大腸桿菌

柯斯質粒載體 -優點
首先,由於柯斯載體兼具了質粒和λ噬菌體兩方面的特性,提高了克隆外源DNA片段的能力,可達45kb左右,因此對於構建真核生物基因文庫是一種特別有用的克隆載體;  其次,應用柯斯質粒作克隆載體,所形成的非重組體的克隆本底比較低,從而提高了篩選具外源DNA的重組體質粒的幾率。

廣告

廣告