基因沉默

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更新時間: 2013-09-10

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基因沉默是指轉基因植物和轉基因動物中往往會遇到這樣的情況,外源基因存在於生物體內,並未丟失或損傷,但該基因不表達或表達量極低的現象。 基因沉寂是真核生物細胞基因表達調節的一種重要手段。在染色體水平,基因沉寂實際上是形成以染色質(Heterochromatin)的過程,被沉寂的基因區段呈高濃縮狀態。

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1 基因沉默 -定義

基因沉默RNA干擾基因沉默

基因沉默(gene silencing)是指生物體中特定基因由於種種原因不表達。一方面,基因沉默是遺傳修飾生物(genetically modified organisms)實用化和商品化的巨大障礙,另一方面,基因沉默是植物抗病毒的一個本能反應,為用抗病毒基因植物工程育種提供了具有較大潛在實用價值的策略——RNA介導的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance,RMVR)。

轉基因植物和轉基因動物中往往會遇到這樣的情況,外源基因存在於生物體內,並未丟失或損傷,但該基因不表達或表達量極低,這種現象稱為基因沉默。

轉基因沉默分為轉錄水平的沉默(TGS)和轉錄后水平的沉默(PTGS)。TGS是指轉基因在細胞核內RNA合成受到了阻止導致基因沉默,PTGS是指轉基因在細胞核中能夠穩定的轉錄,但在細胞質中無對應的mRNA存在。

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2 基因沉默 -簡介

基因沉默RNAi——基因沉默指南

基因沉寂(Gene Silencing) 也可以被稱為「基因沉默」。基因沉寂是真核生物細胞基因表達調節的一種重要手段。在染色體水平,基因沉寂實際上是形成以染色質(Heterochromatin)的過程,被沉寂的基因區段呈高濃縮狀態。

基因沉寂需要經歷不同的反應過程才能實現,包括組蛋白N端結構域的賴氨酸殘基的去乙醯基化加工、甲基化修飾(由甲基轉移酶催化,修飾可以是一價、二價和三價甲基化修飾,後者又被稱為'過度』甲基化修飾(Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修飾的組蛋白結合的蛋白質(MBP)形成「異染色質」,在上述過程中,除了部分組蛋白的N端尾部結構域需要去乙醯化、甲基化修飾之外,有時也許要在其他的組蛋白N端尾部結構域的賴氨酸或精氨酸殘基上相應地進行乙醯化修飾,儘管各種修飾的最終結果會導致相應區段的基因「沉寂」失去轉錄活性。這個「原則」就是目前尚沒有真正完全清楚的「組蛋白密碼」(Histone Code)。能夠與甲基化組蛋白結合的蛋白質有sir1/2/3/4,這是一組被稱為"Silencing Informative Repressor"的蛋白,其中,Sir2就是上文中的「去乙醯化」酶,而Sir1/3/4則負責與甲基化修飾的組蛋白結合"沉寂」相應的染色質為異染色質。

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此外,基因沉寂也和DNA的甲基化修飾有關,比如在真核生物基因組中的許多基因的5『端分佈有長約1KB( 千鹼基對)的「CpG"島序列(CpG island),其中的「C"芳香環5位可被甲基化修飾,之後,與甲基化修飾的DNA結合蛋白形成「沉寂"區段,使其下游基因不能表達;另外,非編碼的RNA分子(non-coding RNA)也參與「基因沉默」過程。這一類型常見於含有重複DNA序列的染色質區,如著絲粒部位的基因沉寂就需要非編碼RNA分子的參與。簡言之,基因沉寂或者基因沉默是涉及組蛋白甲基化、去乙醯化、乙醯化,DNA的甲基化修飾,甲基化修飾組蛋白結合蛋白Sir2/3/4,甲基化DNA結合蛋白,非編碼RNA等等在內的一系列複雜組分的生理反應過程。基因沉寂導致相應區段內的遺傳信息不能被轉錄。

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3 基因沉默 -分類

發生在染色體DNA水平上的轉基因沉默叫做位置沉默;
發生在RNA轉錄水平上的轉基因沉默叫做轉錄沉默;
發生在轉錄后水平的轉基因沉默叫做共抑沉默。

4 基因沉默 -因素

基因沉默因素:位置效應、DNA甲基化、重複序列誘發基因沉默、共抑制。 

5 基因沉默 -發現

基因沉默現象首先在轉基因植物中發現,接著和線蟲、真菌、昆蟲、原生動物以及才鼠中陸續發現。大量的研究表明,環境因子、發育因子、DNA修飾、組蛋白乙醯化程度、基因拷貝數、位置效應、生物的保護性限制修飾以及基因的過度轉錄等都與基因沉默有關。

6 基因沉默 -發生

基因沉默RISC的多次反覆使用也能擴增RNAi的基因沉默效應

基因沉默發生在兩種水平上,一種是由於DNA甲基化、異染色質化以及位置效應等引起的轉錄水平上的基因沉默(tran-scriptional gene silencing,TGS),另一種是轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silen-cing,PTGS),即在基因轉錄后的水平上通過對靶標RNA進行特異性降解而使基因失活。在這兩種水平上引起的基因沉默都與基因的同源性有關,稱為同源依賴性的基因沉默(homology-dependent gene silencing,HDGS)。

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PTGS在多種生物中有共性,對PTGS的激活和與其相關的RNA降解調控過程有了初步的認識。也發現植物病毒在轉基因植物和非轉基因植物中都能和轉基因一樣誘發轉錄后基因沉默。令人吃驚的是,轉基因植物的共抑制現象(轉基因與同源的內源基因一起失活)、轉基因植物的病毒抗性和非轉基因植物對病毒正常自然侵染的抗性、真菌的quelling現象(真菌中的共抑制)、各種動物的RNA干擾(RNA interference,RNAi)以及轉座因子的轉座失活等這些表面看來完全不相關的現象中竟然存在著非常相似的基因沉默機制,即PTGS。這種基因沉默可能是生物體的本能的反應,因為無論是轉基因、轉座因子還是病毒,對植物而言都是誘發突變的外來侵入的核酸,植物為保護自己,在長期的生物進化中,形成了基因沉默這種限制外源核酸入侵的防衛保護機制。 在線蟲Caenorhabditis elegans中,RNAi敏感性缺失突變體中轉座子的轉座活性增強,表明轉座子的轉座失活是被一種類似PTGS的過程調控的,這一過程與RNAi作用有關,是通過細胞內雙鏈RNA互作引起同源特異性的RNA降解。

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PTGS中的RNA在細胞質中的特異性降解並不需要RNA結合到核糖體上,這與通常的RNA降解代謝調控需要與翻譯相關連不同。Bass對RNAi激發的RNA特異性降解機制進了體外研究,發現通過添加外源的雙鏈RNA或靶標mRNA可以激活PTGS,這與早期在植物中發現的雙鏈RNA介導PTGS一致。通過對發生PTGS的轉基因植物進行嫁接實驗和分析植物病毒病的恢復現象觀察到,PTGS是一種系統性的過程,稱為系統獲得性沉默(systemic acquired silencing,SAS)。PTGS的系統傳播性在真菌和線蟲中也得到了證明。進一步研究發現,轉基因或病毒侵染介導的PTGS植物中普遍存在著大量的序列特異性正義和反義的大約25個核苷酸的小分子RNA,而正常的非轉基因植物和沒有發生PTGS的植物中則沒有。這些小分子RNA作為信號分子,在植物中與特定的運輸蛋白特異結合,防止被核酸酶的降解,通過胞間連絲和韌皮部篩管運送到植物體的各個部位,使PTGS具有系統持久性。這一運轉過程與植物病毒在植物體內的運輸有著十分相近的機制。這些-25nt RNA的積累需要轉基因的轉錄或病毒的複製,與其它雙鏈RNA等多種異常RNA相比,-25nt RNA對於PTGS的激發、靶標RNA的特異性降解以及PTGS的系統性維持更為重要。

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早在20世紀70年代初人們就發現,病毒或類病毒侵入植物后,RNA依賴性的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)的活性明顯提高。RdRP是生物體內普遍存在的一種RNA聚合酶,在體外能以單鏈RNA或單鏈DNA甚至以雙鏈RNA為模板,合成與模板互補RNA,合成的cRNA可長達100個核苷酸。1993年,Lindbo等認為在PTGS植物中的RdRP與PTGS同源依賴性的RNA特異性降解有關。最近Mour-rain等[8]從缺失轉基因介導的PTGS擬南芥突變體中分離的sgs2(suppressor of gene silencing)和sde1(silencing defective)兩個基因與番茄中的RdRP基因十分相似,支持了Lindbo的觀點。粗糙脈孢菌Neurospora crassa的qde-2(quilling-defective gene)和線蟲C.elegans的rde-1(RNA interference-deficient gene)與蕃茄的RdRP基因也具有很高的同源性。RdRP基因剔除實驗證明,RdRP對RNAi和PTGS尤為重要。這些研究結果表明,從比較低等的生物藻類、真菌到高等的植物再到動物線蟲、錐蟲、果蠅等中可能存在著一個由共同祖先進化來的相似的抵抗外來DNA侵入自身基因組的本能防衛機制。

RNAi引發的PTGS作為生物體中一種不完全的原始的生物免疫系統,在植物抗病毒中研究得比較詳細。研究發現,植物病毒的RNA可以直接作為PTGS的激發子,並且可能通過病毒來源的基因引發轉基因植物對病毒的終生系統抗性,這和PTGS的從病毒侵染點傳播到整個植株以及線蟲中PTGS的系統性一起證明了PTGS具有系統傳播性。缺少高效PTGS的植物突變體雖然在表型上幾乎沒有變化。擬南芥PTGS突變體sgs2和sgs3對黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)的敏感性提高了,而突變體sde1對煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)和煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)的敏感性無變化。Baulcombe研究組認為RdRP(SDE1或SGS2)對於引發產生PTGS的雙鏈RNA是必需的,有些RNA病毒在複製中用自身的RdRP合成雙鏈RNA直接進入PTGS網路,而不需要寄主的RdRP去激活PTGS,這些病毒如TMV、TRV能在PTGS突變體中和野生型中一樣致病,而另一些病毒如CMV需要寄主的RdRP來激活PTGS,所以PTGS突變體對這些病毒的敏感性要比野生型的高。另一方面,還可能與有些病毒產生的抑制PTGS的蛋白質有關,如CMV和番茄不孕病毒(tomato aspermy virus,TAV)的2b蛋白以及馬鈴薯Y病毒(potato Y virus,PVY)的蚜傳輔助因(helpercomponent/protease,HC-Pro)等。由此可見,不同的RNA病毒是通過不同的位點進入並引發PTGS網路的。由於擬芥南PTGS突變體是通過轉基因介導的PTGS篩選的,突變體對不同病毒敏感性的變化,也可能表明轉基因和病毒侵染引發植物PTGS的機制是有差別的。在突變體sde1中,與PTGS有關的-25nt轉基因特異性的RNA的積累明顯減少,而病毒特異性的-25nt RNA的量不變,這也表明轉基因和侵染病毒是通過不同途徑引發PTGS的。

從大量的研究結果中我們可以推測,生物體內有一套RNA監視系統,可以通過多種異常RNA來激發。如果外來核酸是DNA(包括轉基因、重組基因、DNA病毒、擴增子等),靶標RNA需要在細胞核中完全成轉錄后運轉到細胞質中,而侵入細胞質的病毒RNA可以直接提供靶標RNA。各種不同的靶標RNA(包括與外源基因同源的內源基因和外來的DNA產生的RNA以及病毒的RNA)由寄主的RdRP或病毒自身的RdRP通過多種不同的途徑反靶標RNA轉變成為雙鏈RNA,從而通過RNAi引發的PTGS。PTGS被引發后就不再需要RdRP。關於雙鏈RNA介導的RNAi特異性靶標RNA的降解,Bass提出了這樣一個假說:認為生物體內存在著一種複合酶:RNAi核酸酶,該酶具有雙鏈RNA結合、RNase和RNA解旋酶三個活性區。首先雙鏈RNA結合到該酶的雙鏈RNA結合區並引導該酶識別靶標RNA,接著該酶的解旋酶完成ATP依賴性的靶標RNA與該酶結合的雙鏈RNA的正義鏈的換位,RNase在靶標RNA結合位點附近完成切割,從而使靶標RNA能被進一步降解,產生大量的小片段RNA,包括序列特異性的-25nt RNA。載有序列特異性的雙鏈RNA的遊離複合酶再去識別並降解其它的靶標RNA,產生更多-25nt RNA,從而使PTGS具有持久性系統性。

7 基因沉默 -作用

基因沉默RNA干擾技術:2006年諾貝爾醫學獎成果解讀

基因沉默是基因表達調控的一種重要方式,是生物體在基因調控水平上的一種自我保護機制,在外源DNA侵入、病毒侵染和DNA轉座、重排中有普遍性。

對基因沉默進行深入研究,可幫助人們進一步揭示生物體基因遺傳表達調控的本質,在基因克服基因沉默現象,從而使外源基因能更好的按照人們的需要進行有效表達;利用基因沉默在基因治療中有效抑制有害基因的表達,達到治療疾病的目的,所以研究基因沉默具有極其重要的理論和實踐意義。

8 基因沉默 -意義

基因沉默esiRNA是由核酸內切酶製備

美國最新研究結果顯示:新的基因表達控制技術可能為許多疾病提供新的治療方法。結果發表在《自然生物化學雜誌》(the journal Nature Chemical Biology.)上。

作者德克薩斯州大學的David Corey教授指出:事實上每種疾病都是由於某種水平的自身基因表達失調,或病毒及細菌等微生物的基因表達造成的。理論上基因沉默技術可以治療各種疾病。

作者表示:到目前為止,該研究提供了最權威的證據可以證明染色體DNA是可以操並且能夠被合成的或天然的分子所調控。

只要找到病變基因,就可以利用該技術調控致病基因的表達,或將突變的基因修改回正常狀態,由此治療遺傳性疾病。現在看來這一想法是可行的。

9 基因沉默 -實現新工具

基因沉默esiRNA是由核酸內切酶製備

Sigma-Aldrich公司近日在全球推出MISSION® esiRNA,一種基因特異的siRNA庫,它為哺乳動物細胞中的RNAi篩選提供了一種強有力的方法。與傳統的合成siRNA不同,esiRNA集合了數百個針對單個基因靶點的siRNA。這種新工具能避免鑒定有效siRNA的反覆試驗過程,迅速實現基因沉默,並確保脫靶效應最低。

此項技術與傳統的單個siRNA介導的基因knockdown相比,優勢相當明顯。以前,我們需要反覆試驗,來鑒定出最有效的siRNA,現在有了這個siRNA的「超級庫」,這一步都省了。此外,esiRNA還能確保最低的脫靶效應。esiRNA是由德國馬普學會細胞生物學和遺傳學(MPI-CBG)開發的。

MPI-CBG的課題組組長Frank Buchholz開創了esiRNA技術在RNAi篩選中的應用。他表示:「我們很高興能與Sigma-Aldrich合作,讓整個學術界都能享有esiRNA技術。10年前,esiRNA在美國舊金山加州大學的Mike Bishop實驗室中發明。自此,它就成為我的研究重點。Sigma-Aldrich在RNAi方面的豐富經驗和產品線是我們生產高效特異esiRNA的完美補充。」

哈佛大學醫學院正在運用esiRNA來協助鑒定促使HIV增殖的人類基因。臨床研究員Abraham Brass博士認為MISSION esiRNA的初步試驗結果表明多個基因都能被非常有效地knockdown。哈佛醫學院很快將會把此項技術整合到多項研究中。

esiRNA是由核酸內切酶製備的。首先用特異的引物擴增最佳的靶區域。序列經過驗證后,利用RNA聚合酶產生300-600 bp基因特異的雙鏈RNA,隨後用核酸內切酶切割產生短的dsRNA。這些類似siRNA的分子經過純化,就形成了siRNA庫,它們靶定了單個基因的不同序列。

MISSION esiRNA具有下列優勢:

針對每個基因靶點的MISSION esiRNA超級庫
快速經濟地完成初次篩選
有效的基因沉默
esiRNA的knockdown效率高於70%
脫靶效應更低
大型RNAi篩選研究的費用更省

目前,MISSION esiRNA有以下幾種規格,滿足不同實驗的需求:
MISSION esiRNA人基因組規模庫,覆蓋12000多個基因靶點
MISSION esiRNA人激酶庫,覆蓋500多個基因靶點
定製MISSION esiRNA庫(20 ug),適於10到1000個基因靶點
單個MISSION esiRNA(20 ug或50 ug),適於1到10個基因靶點

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