原子力顯微鏡

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更新時間: 2013-08-23

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原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope ,AFM),一種可用來研究包括絕緣體在內的固體材料表面結構的分析儀器。它通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質的表面結構及性質。將一對微弱力極端敏感的微懸臂一端固定,另一端的微小針尖接近樣品,這時它將與其相互作用,作用力將使得微懸臂發生形變或運動狀態發生變化。掃描樣品時,利用感測器檢測這些變化,就可獲得作用力分佈信息,從而以納米級解析度獲得表面結構信息。

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生物型原子力顯微鏡

  生物型原子力顯微鏡

它主要由帶針尖的微懸臂、微懸臂運動檢測裝置、監控其運動的反饋迴路、使樣品進行掃描的壓電陶瓷掃描器件、計算機控制的圖像採集、顯示及處理系統組成。微懸臂運動可用如隧道電流檢測等電學方法或光束偏轉法、干涉法等光學方法檢測,當針尖與樣品充分接近相互之間存在短程相互斥力時,檢測該斥力可獲得表面原子級分辨圖像,一般情況下解析度也在納米級水平。AFM測量對樣品無特殊要求,可測量固體表面、吸附體系等。

3優缺點

4儀器結構

5工作模式

6樣品的要求

原子力顯微鏡研究對象可以是有機固體、聚合物以及生物大分子等,樣品的載體選擇範圍很大,包括雲母片、玻璃片、石墨、拋光矽片、二氧化硅和某些生物膜等,其中最常用的是新剝離的雲母片,主要原因是其非常平整且容易處理。而拋光矽片最好要用濃硫酸與30%雙氧水的7∶3 混合液在90 ℃下煮1h。利用電性能測試時需要導電性能良好的載體,如石墨或鍍有金屬的基片。
試樣的厚度,包括試樣台的厚度,最大為10 mm。如果試樣過重,有時會影響Scanner的動作,請不要放過重的試樣。試樣的大小以不大於試樣台的大小(直徑20 mm)為大致的標準。稍微大一點也沒問題。但是,最大值約為40 mm。如果未固定好就進行測量可能產生移位。請固定好后再測定。
隨著科學技術的發展,生命科學開始向定量科學方向發展。大部分實驗的研究重點已經變成生物大分子,特別是核酸和蛋白質的結構及其相關功能的關係。因為AFM的工作範圍很寬,可以在自然狀態(空氣或者液體)下對生物醫學樣品直接進行成像,解析度也很高。因此,AFM已成為研究生物醫學樣品和生物大分子的重要工具之一。AFM應用主要包括三個方面:生物細胞的表面形態觀測;生物大分子的結構及其他性質的觀測研究;生物分子之間力譜曲線的觀測。
AFM對生物細胞的表面形態觀察
AFM可以用來對細胞進行形態學觀察,並進行圖像的分析。通過觀察細胞表面形態和三維結構,可以獲得細胞的表面積、厚度、寬度和體積等的量化參數等。例如,利用AFM可以對感染病毒后的細胞表面形態的改變、造骨細胞在加入底物(鈷鉻、鈦、鈦釩等)后細胞形態和細胞彈性的變化、GTP對胰腺外分泌細胞囊泡高度的影響進行研究。利用AFM還可以對自由基損傷的紅細胞膜表面精細結構的研究,直接觀察到自由基損傷,以及加女貞子保護作用后,對紅細胞膜分子形態學的影響。
生物大分子的結構及其他性質的觀測研究
2.1 蛋白質
對於蛋白質,AFM的出現極大的推動了其研究進展。AFM可以觀察一些常見的蛋白質,諸如白蛋白,血紅蛋白,胰島素及分子馬達和噬菌調理素吸附在圖同固體界面上的行為,對於了解生物相溶性,體外細胞的生長,蛋白質的純化,膜中毒有很大幫助。例如,Dufrene 等利用AFM 考察了吸附在高分子支撐材料表面上的膠原蛋白的組裝行為。結合X-射線光電子能譜技術和輻射標記技術,他們提出了一個定性解釋其層狀結構的幾何模型。AFM 實驗證實了膠原蛋白組裝有時連續,有時不連續的性質,通過形貌圖也提供了膠原蛋白纖維狀結構特徵。Quist等利用AFM 研究了白蛋白和豬胰島素在雲母基底上的吸附行為,根據AFM 圖上不同尺寸的小丘狀物質推測,蛋白質有時發生聚集,有時分散分佈。Epand 等則利用AFM 技術研究了一類感冒病毒的紅血球凝集素,首次展示了一種膜溶原蛋白自組裝形成病毒摺疊蛋白分子外域的實時過程。
在AFM 觀察包裹有紫膜的噬菌調理素蛋白(BR) 的研究中,AFM 儀器的改進,檢測技術的提高和制樣技術的完善得到了集中的體現。在細胞中,分子馬達可以將化學能轉變為機械運動,防止因為布朗運動導致的細胞中具有方向性的活動出現錯誤,這些活動包括:肌漿球蛋白,運動蛋白,動力蛋白,螺旋酶,DNA 聚合酶和RNA 聚合酶等分子馬達蛋白的共同特點是沿著一條線性軌道執行一些與生命活動息息相關的功能,比如肌肉的收縮,細胞的分化過程中染色體的隔離,不同細胞間的細胞器的置換以及基因信息的解碼和複製等。由於分子馬達本身的微型化,它們容易受更高的熱能和大的波動的影響,了解馬達分子如何正常有序工作就成為一項具有挑戰性的任務。利用AFM,人們已經知道了肌動蛋白結合蛋白的結構信息和細胞運動過程中肌動蛋白骨架調控功能。
2.2 脫氧核糖核酸(DNA)
AFM液相成像技術的優點在於消除了毛細作用力,針尖粘滯力,更重要的是可以在接近生理條件下考察DNA 的單分子行為。DNA 分子在緩衝溶液或水溶液中與基底結合不緊密,是液相AFM面臨的主要困難之一。硅烷化試劑,如3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和陽離子磷脂雙層修飾的雲母基底固定DNA 分子,再在緩衝液中利用AFM 成像,可以解決這一難題。在氣相條件下陽離子參與DNA的沉積已經發展十分成熟,適於AFM 觀察。在液相條件下,APTES 修飾的雲母基底較常用。目前DNA的許多構象諸如彎曲,超螺旋,小環結構,三鏈螺旋結構,DNA 三通接點構象,DNA 複製和重組的中間體構象,分子開關結構和藥物分子插入到DNA 鏈中的相互作用都廣泛地被AFM考察,獲得了許多新的理解。
2.3 核糖核酸( RNA)
AFM對RNA的研究還不是很多。結晶的轉運RNA 和單鏈病毒RNA 以及寡聚Poly (A) 的單鏈RNA 分子的AFM 圖像已經被獲得。因為在於不同的緩衝條件下,單鏈RNA 的結構變化十分複雜,所以單鏈RNA 分子的圖像不容易採集。(利用AFM成像RNA分子需要對樣品進行特殊和複雜的處理。Bayburt 等借鑒Ni2 + 固定DNA 的方法在緩衝條件下獲得了單鏈Pre-m RNA 分子的AFM 圖像。他們的做法如下: (1) 用酸處理被Ni2 + 修飾的雲母基底以增加結合力; (2) RNA 分子在70℃退火,慢慢將其冷卻至室溫再滴加在用酸處理過的Ni2 +-雲母基底上。採用AFM 單分子力譜技術,在Mg2 + 存在的溶液中,Liphardt 等研究了形貌多變的RNA 分子的機械去摺疊過程,發現了從髮夾結構到三螺旋連接體這些RNA 分子三級結構的過渡態。隨後他們又利用RNA 分子證實了可逆非平衡功函和可逆平衡自由能在熱力學上的等效性。)
2.4 核酸與蛋白質複合物( Nuclearacids-Protein Complex)
DNA 和蛋白質分子的特定相互作用在分子生物學中起著關鍵作用。蛋白質與DNA 結合的精確位點圖譜和不同細胞狀態下結合位點的測定對於了解複雜細胞體系的功能與機理,特別是基因表達的控制都十分關鍵。AFM 作為一種高度分辨達0。1 nm,寬度解析度為2 nm 左右的表面分析技術,已廣泛地用於表徵各類DNA-蛋白質的複合物。低濕度大氣條件下,Rees 等利用AFM 在接觸模式下考察了λ2PL 啟動子在啟動和關閉轉錄過程中對DNA 鏈彎曲程度的影響。此外,這個小組還研究了另外一種λ2轉錄因子,Cro-蛋白對DNA 彎曲的影響。為了研究Jun 蛋白的結合是否會引起DNA 鏈的彎曲,Becker等利用AFM研究了包含一個AP21 結合位點的線性化質粒DNA 與Jun 蛋白的複合物。Aizawa小組對DNA 蛋白激酶Ku 亞結構域和雙鏈DNA斷裂的相關性進行了研究。Kasas 等研究了大腸桿菌RNA 聚合酶(RNAP) 轉錄過程中的動態酶活性。他們的方法是在Zn2 + 存在的條件下,RNAP 能夠鬆散或緊密地與DNA 模板進行結合,通過AFM 成像了解其動態過程。
2.5 細胞( Cell)
AFM 不僅能夠提供超光學極限的細胞結構圖像,還能夠探測細胞的微機械特性,利用AFM 力-曲線技術甚至能夠實時地檢測細胞動力學和細胞運動過程。利用AFM 研究細胞很少用樣品預處理,尤其是能夠在近生理條件下對它們進行研究。
利用AFM 直接成像方法,可以對固定的活細胞和亞細胞結構進行了深入研究。這些研究獲得了關於細胞器的構造,細胞膜和細胞骨架更詳細的信息。將細胞固定在基底上再進行AFM 觀察,可以得到細胞膜結構的皺褶,層狀脂肪物,微端絲和微絨毛等特徵。由於細胞質膜掩蓋了細胞內部骨架,現在已經發展了一種仔細剝離該層膜的方法,並利用AFM 對剝離細胞膜后的結構進行了研究。
AFM 在細胞研究方面的一個最重要用途是對活細胞的動力學過程,細胞間的相互作用以及細胞對其內外干擾因素的響應進行實時成像目前,AFM已經可以對外來病毒感染的細胞進行實時考察。AFM還可以研究活性狀態下血小板形狀的變化情況和培養的胰腺細胞對澱粉消化酶的響應情況。
2.6病毒( Virus)
早期,AFM 在生物學上的應用主要集中在病毒研究。Kolbe 等首次研究了具有不同頭尾結構的T4 噬菌體。Imai 及其合作者分別對煙草花葉病毒和各類噬菌體進行了考察。煙草花葉病毒( TMV) 或星形煙草花葉病毒(STMV) 是迄今研究得最多的病毒類型。在膠體溶液中,TMV非常類似已知的蛋白質行為,可以採用研究蛋白質的方法對其進行考察。利用AFM,可以研究高度過飽和和輕微過飽和條件下TMV的二維成核生長過程。AFM研究表明,當TYMV 暴露在平衡條件下的溶液中,TYMV 晶體的(101) 面逐層向上生長,晶格的結構缺陷如空位,單粒子,位錯和聚集等現象在AFM 圖上區分得十分清楚。Turner 等利用從AIDS 病毒中提取的逆轉錄酶修飾AFM橫樑,使之成為一種能檢測抑制酶的活力和篩選使AIDS 病毒失活藥物的方法。自支撐磷脂膜與感冒病毒結合作用以及缺陷位點結構上底物暴露的磷脂單層效應和水合雙層磷脂的檢測被發展成了一種新型生物感測器,這種感測器能夠從其它大分子中識別特定的病毒物質。這些結果都被AFM 圖像所證實。
生物分子間力譜曲線的觀測
對生物分子表面的各種相互作用力進行測量,是AFM的一個十分重要的功能。這對於了解生物分子的結構和物理特性是非常有意義的。因為這種作用力決定兩種分子的相互吸引或者排斥,接近或者離開,化學鍵的形成或者斷裂,生物分子立體構像的維持或者改變等等。在分子間作用力的支配下,還同時支配著生物體內的各種生理現象、生化現象、藥物藥理現象,以及離子通道的開放或關閉,受體與配體的結合或去結合,酶功能的激活或抑制等等。因此,生物分子間作用力的研究,在某種意義上說,就是對生命體功能活動中最根本原理的研究。這也為人們理解生命原理,提供了一個新的研究手段和工具。
將兩種分子分別固定於AFM的基底和探針尖端上。然後使帶有一種分子的探針尖端在垂直方向上不斷地接近和離開基底上的另一種分子。這時,兩種分子間的相互作用力,就是二者間的相對距離的函數。這種力與距離間的函數關係曲線,稱之為力譜曲線。
利用AFM獲得的力譜曲線在生物醫學中的應用:在探測一個細胞之後,根據所遇到的阻力,AFM就會賦予一個表明細胞柔軟度的數值。研究人員發現,儘管正常細胞的硬度各有不同,但癌細胞比正常細胞要柔軟得多,所研究的胰腺、肺部和乳腺細胞均是如此。一些腫瘤的細胞可能比另外一些更為堅硬,那就意味著這些腫瘤惡化轉移的可能性較小,對病人的威脅也較小。利用AFM還可以研究不同藥物對癌細胞的影響。針對細胞用藥后,AFM可以觀察在藥物的作用下細胞的變化情況。這樣可以開發出比當前所用的藥物毒性更小、但同樣能夠阻止正常細胞發生癌變的藥物,以免因癌症擴散而危及生命。

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