凝膠過濾

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更新時間: 2013-08-30

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凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過濾。具有分子篩作用的物質很多,如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應用最廣,商品名是sephadex型號很多,從G10到G200,它的主要應用範圍是:①分級分離各種抗原與抗體;②去掉複合物中的小分子物質。如除鹽、熒光素和遊離的放射性同位素以及水解的蛋白質碎片;③分析血清中的免疫複合物;④分子量的測定。

凝膠過濾 -概述

凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用,根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質,多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質,小分子物質能進入其內部,流下來速度慢,而大分子物質卻被排除在外部,下來的速度快,當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時,溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

它的突出優點是層析所用的凝膠屬於惰性載體,不帶電荷,吸附力弱,操作條件比較溫和,可在相當廣的溫度範圍下進行,不需要有機溶劑,並且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對於高分子物質有很好的分離效果。

凝膠過濾 -原理

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質,當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時,由於它們的分子量不同而表現出速度的快慢,在緩衝液洗脫時,分子量大的物質不能進入凝膠孔內,而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動,而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行「繞道」運行,這樣就可以按分子量的大小,先後流出凝膠柱,達到分離的目的。

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凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術,又稱之凝膠過濾,分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象個"篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個足夠長的柱子中,作成一個凝膠柱。當含有大小不同的蛋白質樣品加到凝膠柱上時,比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質就要連續不斷地穿入珠子的內部,這樣的小分子不但其運動路程長,而且受到來自凝膠珠內部的阻力也很大,所以越小的蛋白質,把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長。凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此,大的蛋白質直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決於要純化的蛋白質分子量。

凝膠過濾 -操作

⒈凝膠的選擇

根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開,由於它們在分配係數上有顯著差異,這種分離又稱組別分離,一般可選用SephadexG-25和G-50,對於小肽和低分子量的物質(1000-5000)的脫鹽可使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離,這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠,層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部,由於Kd不同,最後得到分離。

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⒉柱的直徑與長度

根據經驗,組別分離時,大多採用2-30cm長的層析柱,分級分離時,一般需要100cm左右長的層析柱,其直徑在1-5cm範圍內,小於1cm產生管壁效應,大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間,但對移動慢的物質宜在30-40之間。

⒊凝膠柱的製備

凝膠型號選定后,將干膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹,溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長,加熱可使溶脹加速,即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸,1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。

凝膠的裝填:將層析柱與地面垂直固定在架子上,下端流出口用夾子夾緊,柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器,柱內充滿洗脫液,將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中,然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內,這樣凝膠粒水平上升,直到所需高度為止,拆除柱頂裝置,用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間,再開始流動平衡,流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速,千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜,使用前要檢查層析床是否均勻,有無「紋路」或氣泡,或加一些有色物質來觀察色帶的移動,如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好,色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。

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⒋加樣和洗脫

凝膠床經過平衡后,在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和,再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配係數無關,故樣品濃度可以提高,但分子量較大的物質,溶液的粘度將隨濃度增加而增大,使分子運動受限,故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入后打開流出口,使樣品滲入凝膠床內,當樣品液面恰與凝膠床表面相平時,再加入數毫升洗脫液中洗管壁,使其全部進入凝膠床后,將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連,預先設計好流速,然後分部收集洗脫液,並對每一餾份做定性、定量測定。

⒌凝膠柱的重複使用、凝膠回收與保存

一次裝柱后可以反覆使用,不必特殊處理,並不影響分離效果。為了防止凝膠染菌,可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉,在下次層析前應將抑菌劑除去,以免干擾洗脫液的測定。

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如果不再使用可將其回收,一般方法是將凝膠用水沖洗乾淨濾干,依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90%以上,濾干,再用乙醚洗去乙醇、濾干、乾燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性,密封后高壓滅菌保存。

凝膠過濾 -凝膠層析的應用

⑴脫鹽:

高分子(如蛋白質、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質,可以用凝膠層析法除去,這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長與直徑之比為5-15,樣品體積可達柱床體積的25%-30%,為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉澱吸附於柱上,一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩衝液使層析柱平衡,然後加入樣品,再用同樣緩衝液洗脫,收集的洗脫液用冷凍乾燥法除去揮發性鹽類。

⑵用於分離提純:

凝膠層析法已廣泛用於酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物鹼等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力,可用來去除無離子水中的致熱原製備注射用水。

⑶測定高分子物質的分子量:

用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內,在同一條件下層析,記錄每一分鐘成分的洗脫體積,並以洗脫體積對分子量的對數作圖,在一定分子量範圍內可得一直線,即分子量的標準曲線。測定未知物質的分子量時,可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內洗腫后,根據物質的洗脫體積,在標準曲線上查出它的的分子量。

⑷高分子溶液的濃縮:

通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中,這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中,而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外,再經離心或過濾,將溶脹的凝膠分離出去,就得到了濃縮的高分子溶液。

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