免疫PCR法

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更新時間: 2013-09-07

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免疫PCR法。免疫PCR(immuno polymerase chain reaction,IM-PCR)是1992年Sano建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合起來,其本質是一種以PCR擴增一段DNA報告分子代替酶反應來放大抗原抗體結合率的一種改良型ELISA。它的基本原理是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應,PCR擴增粘附在抗原抗體複合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據特異性PCR產物的有無,來判斷待測抗原是否存在

      免疫PCR(immuno polymerase chain reaction,IM-PCR)是1992年Sano建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合起來,其本質是一種以PCR擴增一段DNA報告分子代替酶反應來放大抗原抗體結合率的一種改良型ELISA。它的基本原理是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應,PCR擴增粘附在抗原抗體複合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據特異性PCR產物的有無,來判斷待測抗原是否存在。免疫PCR是迄今最敏感的一種抗原檢測方法,理論上可以檢測單個抗原分子,但實踐中它的敏感性受許多因素的影響,如連接分子、顯示系統的選擇、DNA報告分子的濃度、PCR循環次數等。目前,國內外報道免疫PCR的敏感性一般比現行的ELISA法高102~108倍。由於PCR產物在抗原量未達到飽和前與抗原抗體複合物的量成正比,因此免疫PCR還可用於抗原的半定量試驗。

免疫PCR法 -1 免疫PCR的應用
    免疫PCR的高敏感性使低於常規檢測方法極限的痕量抗原的檢測成為可能。目前主要用於檢測腫瘤標誌物、細胞因子、神經內分泌活性多肽、病毒抗原、細菌、酶、支原體、衣原體等微量抗原。免疫缺陷病人血中的IL-18低於正常人水平,ELISA法檢測受到一定的局限,Furuga用免疫PCR成功的檢測到2.5pg/L的IL-18,其敏感性比ELISA高1.6× 104倍。用免疫PCR檢測β葡萄酸酶也取得了類似的結果。

免疫PCR法 -2 免疫PCR的種類
    2.1  原位免疫PCR(in situ immuno,PCR)  是一種原位檢測組織或細胞中抗原的技術。待檢石蠟切片上的非特異性結合位點經過充分封閉,內源性DNA和RNA經核酶充分消化后,通過生物素化單抗與親和素系統的橋聯,將生物素化的DNA報告分子固定在石蠟切片上,進行原位PCR擴增,擴增產物經原位核酸雜交,以雜交信號指示待測抗原是否存在。Cao用原位免疫PCR檢測肝石蠟切片上的乙肝表面抗原(HBsAg),其敏感性較免疫組化法顯著提高。

    2.2  細胞免疫PCR(cellular immuno,PCR)  通常用來檢測細胞表面膜抗原。Zhang用此法成功的檢測了白血病病人血清中轉移癌細胞上的腫瘤抗原GM3。首先用抗CM3單抗製備單抗-親和素-生物素化複合體,然後分離病人外周血淋巴細胞,充分洗滌封閉后,與單抗DNA複合體共育,洗滌后抽提細胞總DNA,利用DNA報告分子的特異性引物進行PCR擴增,擴增產物經Southern blot顯示結果,病人外周血淋巴細胞可擴增出300bp的特異性條帶,正常人無。

    2.3  多分析物免疫PCR  利用大小不同的DNA分子標記不同的抗體,可同時檢測多種抗原。Joerger用99個鹼基的DNA分子標記hCG抗體,用88個鹼基的DNA分子標記hT-SH抗體,同時檢測hCG、hTSH兩個分析物,兩個DNA報告分子共用一對引物,但PCR產物的分子量不同,從而使兩個抗原得以鑒別。

    2.4  單引物免疫PCR  即DNA報告分子的兩側累含有相同的引物序列,可用單引物進行PCR擴增。該法可提高PCR擴增效率,且適合於多分析物免疫PCR。

免疫PCR法 -3  連接分子
    免疫PCR需要適當的連接分子連接報告分子和抗原抗體複合物。1992年Sano用重組的鏈親和素-蛋白A嵌合體作為連接分子,創立了免疫PCR技術。該融合蛋白的蛋白A可結合抗體的Fc段,鏈親和素可結合DNA分子上的生物素,Sano利用此連接分子把一段生物素化的DNA片斷(pUC19質粒DNA)連接到固定在酶標板上的抗原抗體複合物上,成功的檢測到了牛血清蛋白,比傳統ELISA法的敏感生105倍。1993年,Ruzicha用生物素化單抗-親和素-生物素化DNA分子複合體代替鏈親和素-蛋白A嵌合體連接的單抗DNA複合體。Zhou等人發現鏈親和素(streptavidin)不含糖基,做連接分子特異性優於親和素(avidin);Marian進一步指出中性鏈親和素(neutravidin)特異性比鏈親和素更佳,因為前者是一種經過特殊修飾了的親和素,大大降低了非特異性吸附的可能。此後鏈親和素(親和素)系統被廣泛應用,二者作為免疫PCR的連接分子各有優缺點。鏈親和素-蛋白A嵌合體均一穩定,結果重複性好,並且此嵌合蛋白可以利用工程菌大量生產,價格低廉。但目前尚無商品化的產品可以利用,且蛋白A可以結合非特異性吸附的抗體或用於捕獲抗原的抗體的Fc段,使之不能用於夾心法。預先把特異性抗體和該連接分子製成複合物可解決上述問題,用抗體的Fab或F(ab′)2段代替捕獲抗原的一抗也可克服以上困難。生物素、鏈親和素系統有商品化的生物素標記的二抗和遊離鏈親和素可以利用,因而被國內外學者廣泛採用。但親和素為四價化合物,在製備親和素-生物素化DNA複合體(avidin-biotinylated-DNA complex ABD complex)時會出現3種情況5種分子,即遊離親和素、部分飽和親和素(結合1~3個生物素分子)、飽和親和素。只有部分飽和親和素對檢測有用,其他兩種情況不但對檢測無用而且佔用檢測位點,降低免疫PCR的敏感性。有的學者採用分別加入生物素化二抗、遊離親和素生物素化DNA分子的方法克服了以上缺點,但延長了檢測周期,使檢測步驟繁鎖,增加了系統誤差。有人用2-亞氨基生物素做配基的瓊脂糖珠親和層析法製備ABD複合物,克服了以上不足。

免疫PCR法 -4 報告分子
    理論上任何一段序列已知、可有效擴增的DNA片斷都可作為免疫PCR的報告分子,但考慮到DNA序列的同源性和用於PCR擴增的效率問題,該報告分子和PCR擴增系統必須保證有良好的擴增效果,有近擬理論的擴增率,該報告分子與反應體系中可能存在DNA分子不應有同源性,以避免因DNA污染,而出現特異性擴增。繼Sano用PUC19質粒后,國內外學者先後用PINM30、λ噬菌體、舌蘭病毒等作為報告分子,取得了良好的效果。鄭永晨研究發現線性化的腺病毒六鄰體(ADAT)基因重組質粒非常適於做免疫PCR的報告分子。目前免疫PCR的報告分子多數是用DNA聚合酶將生物素化的鹼基聚合到DNA末端,理論上一條DNA鏈上只標記一個生物素分子才具有最高的敏感性。AdAt質粒易於製備和純化,分子較單一,不易出現非特異擴增,經Hind Ⅲ 酶切后粘性末端上只有加一個生物素分子,保證了免疫PCR的最高敏感性。質粒pHNL10含有編碼木薯羥基腈裂解酶的基因,該基因片段是從木薯cDNA文庫中經PCR擴增所得,植物DNA與檢測系統中可能存在的任何DNA都不同源,用它做免疫PCR的報告分子,可避免因DNA污染而造成的非特異性擴增。

免疫PCR法 -5 免疫PCR的載體

    由於適合抗原抗體反應的酶標板不能插入普通PCR儀進行PCR反應,Sano先在酶標板上進行抗原抗體反應和報告分子的連接反應,然後經過熱變性,把酶標板上的報告分子轉移到普通PCR管中進行PCR反應。此法簡單、經濟,但步驟繁鎖,容易在轉移過程中丟失樣品,系統誤差大,結果不穩定。國外有人用特殊的96孔中V形板做載體,所有步驟均在同一板上進行,最後插入特殊的PCR儀進行擴增。此法克服了上述缺點,但需特殊的PCR儀,價格昂貴,目前尚不能在國內推廣普及。用於PCR反應的eppendof管多用聚氯乙烯,在材料上有別於酶標反應板,不適合包被抗原(抗體)。徐平西等人用戊二醛做包被劑將抗原(抗體)高效率地包被於普通PCR管,使免疫PCR能利用普通PCR儀在同一管中連貫進行。

免疫PCR法 -6  免疫PCR的顯示系統
  最基本的顯示方法是凝膠電泳法。PCR產物經葡聚糖凝膠電泳后,EB染色,紫外線燈下觀察或照像,出現特異性擴增帶為陽性。也有人將電泳后的PCR產物印記在硝酸纖維素膜上進行核酸雜交,以雜交信號顯示檢測結果。另外也可不用電泳,在PCR擴增時用放射性同位素、熒光素、生物素、酶等標記引物,使PCR產物帶有一定標記,然後通過放射自顯影、熒光顯微鏡、酶底物顯色等顯示檢測結果。凝膠電泳法既適合單抗原的檢測,又適合多抗原的檢測,且能區分PCR產物的特異性擴增帶和非特異性擴增帶,除了EB染液對人體有害需防護外,對環境基本無污染,因而被廣泛應用。其他方法一般只適合於單抗原檢測,對引物要求較高,且無法區分非特異性擴增帶,因此應用較少。

免疫PCR法 -7 假陽性的控制
    充分洗滌是必要的,有的學者總共用了50多次洗滌,最大限度地消除了非特異性吸附,但同時也增加了檢測步驟,延長了檢測周期。充分封閉非特異性結合位點也至關重要,常用的封閉劑有牛血清蛋白(BSA)、脫脂奶粉、鮭魚精DNA,Chang在PBS中加入2%的BSA取得了良好的效果。適當降低報告分子的濃度,採用不等量引物(適當減少其中一種引物的濃度)均可減少非特異性擴增,提高特異性。另外應設立假陽性指示分子和陰性對照。

免疫PCR法 -8 免疫PCR的優化策略
    8.1  新型連接分子的出現

      8.1.1  葉綠素分子和鏈酶卵白素  喬生軍等用自然界普遍存在的葉綠素分子(chlorophy)作為共價連接蛋白與核酸的中間分子,構建了甲胎蛋白(AFP)抗體的基因探針,此探針人為地把抗體直接錨定在雙鏈DNA分子上,複合分子性質均一穩定,室溫至少保存6個月,大大簡化了中間步驟,降低了成本,使免疫PCR更易推廣。也有人用鏈酶卵白素將生物素化的抗體與生物素化的DNA分子直接連接,也得了良好的較果。

      8.1.2  雙特異融合蛋白  任軍將編碼單鏈抗體和鏈親和素融合蛋白的基因插入載體在大腸桿菌中進行表達,獲得了具備結合生物素和抗原分子的雙特異性融合蛋白,可直接連接抗體和生物素化的DNA分子。該融合蛋白可利用工程菌大量製備,性質優良,價格低廉。

    8.2  生物素化F(ab′)2段代替生物素化單抗  抗體的Fab或F(ab′)2易於標記,且因缺乏Fc段大大降低了非特異性吸附的可能性,使免疫PCR的本底大為降低。Yashito用胃蛋白酶消化單抗,把得到的Fab段用生物素標記,以此來檢測ANP,使其特異性大為提高。

    免疫PCR以現存檢測無可比擬的高敏感性顯示了巨大的優越性,必將在疾病的診斷中發揮巨大的作用。但目前該技術尚未完全成熟,免疫PCR過程中的每一環節都影響它的敏感性和特異性,因此探索最佳反應條件,簡化步驟,降低費用,實現標準化,商品化生產,使之易於在基層推廣至關重要。近年來國內外學者在這方面做了大量工作,其中新型連接分子是關鍵,隨著基因工程、化學合成及二次雜交等技術的進步,雙特異性抗體、雙特異性重組蛋白、雙特異性化學合成分子等新型連接分子的不斷湧現,使抗體與DNA分子直接連接,為解決上述問題提供了有利條件。

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