免疫磁性微球

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更新時間: 2013-09-04

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免疫磁性微球主要用於細胞分離等方面。由於它能特異性地與靶物質結合併使之具有磁響應性,因此將免役磁性微球與含有靶物質(欲分離的物質)的複雜混合物共同培養。

  微球與抗體的連接有吸附結合與共價結合兩種形式,吸附結合依靠微球表面對抗體的非特異吸附力,而共價結合依靠微球表面的活性基團與抗體共價反應。吸附結合只有在微球具有非常大的表面積時才有可能比較牢固,這樣,對於表面比較平整的微球,就要通過對其表面進行處理來提高它的抗體結合力,以保證IMMS表面有足夠的抗體[75]。經過表面處理的磁性微球與單抗在適當的緩衝液中培養,抗體通過物理吸附很快地與磁性微球結合,如果微球表面有活性基團,則接下來就會通過較慢的化學反應共價結合在磁性微球的表面。

  免疫磁性微球主要用於細胞分離等方面。由於它能特異性地與靶物質結合併使之具有磁響應性,因此將免役磁性微球與含有靶物質(欲分離的物質)的複雜混合物共同培養。則免疫性微球可以通過抗原抗體反應選擇性地與靶物質結合,當此化合物通過一個磁場裝置時,與免疫磁性微球結合的靶物質就會被磁場滯留,從而與其他複雜物質分離開來。

  用於細胞分離的免疫磁性微球具備以下條件:化學性能穩定,不產生凝聚;不與細胞發生非特異性的結合;磁性微球與抗體的結合牢固;磁性微球的大小均勻,磁響應性好,磁性納米材料的含量均勻一致;磁性微球大小適當,不易被細胞所吞噬。

  IMM與細胞的結合可以採取兩種方法,直接法和間接法。直接法是指抗體直接連在磁性微球上,然後與靶細胞結合。間接法是指先將細胞與特異抗體混合培養,使特異抗體結合在細胞表面,然後加入預先用抗鼠IgG(二抗)處理的磁性微球。使磁性微球間接地與靶細胞結合。直接法可以減少洗滌和培養步驟,但對IgM單抗很少能使用。間接法與直接法相比,除適當範圍廣外,還可以使用一組單克隆抗體,因而會獲得更好的細胞清除效果。但要經過多次的洗滌步驟,特異性也會有所降低。

  針對單核細胞的單克隆抗體的發展使得分離帶有特異表面標記的細胞成為可能。一般有3類不同的方法,即流式細胞儀技術(PACS)、表面聯上二抗的異體紅細胞花環技術、將抗體被動吸附在聚苯乙烯組織養板上的Panning技術。這些技術都有各自的缺點。FACS價格昂貴,技術複雜,經常會被所分選細胞的容量、活性、無菌度等問題所困擾;紅細胞花環技術無法處理大量的細胞,另外,至今尚無一成熟、簡便的方法能夠將抗體偶聯至紅細胞膜上;Panning技術也有很多局限性,它難與放大操作,步驟煩瑣,不能定量,靶細胞經常混雜著非特異抗體吸附在培養板底部的其他細胞。相對而言,免疫磁性微球具有操作簡便、分離迅速完全、細胞純度高等優點,尤其在操作簡便省時方面,其他分離方法很難比擬。

  磁珠是細胞分選的關鍵,以Miltenyi Biotec公司已申請專利的MACS磁珠為例,該磁珠直徑只有50nm,相當於一個病毒粒子的大小,只有真核細胞的百萬分之一,用掃描電鏡也僅能看到細胞表面的磁珠,這種磁珠能形成穩定的膠體溶液,在磁場中既不沉澱也不聚合。磁珠的組成是鐵氧化物和多糖,最多只結合細胞表面三分之一的特徵抗原。而且由於體積極小,能被細胞降解,且不會激活或影響細胞的功能和活力,細胞的生理功能也不變,因此細胞分離后無需去除磁珠,陽性分選出的細胞(即磁性標記細胞)可立即用於分析和隨後的實驗。

  MACS技術可以分離出非常純的細胞群體,而且極好的回收率和存活率。依據細胞頻率和抗原標誌表達水平的不同,分離細胞的純度可達95%-99.9%、回收率>90%。

  MACS技術一步性陽性選擇出的細胞數可達109。無論起始的細胞量是105或是1011,都用同一簡單的操作過程。磁性標記細胞約15分鐘,用分選柱分離磁性細胞只需幾分鐘時間。可以用不同規格的柱子來隨意分選不同數量的細胞。

  被磁性標記的細胞可同時用結合有抗體的熒光染料對同樣的標誌進行染色,從而可對細胞分選作質控和分析。由於MACS的微型磁珠是亞微觀的,因此不會影響標記細胞的散射光。經MACS分選的細胞可以直接用流式細胞術來測定其純度,也可以與熒光顯微鏡術、PCR或FISH兼容。

  MACS技術可以很好地對低達10-8的稀有細胞進行陽性分選。對於那些頻率更低的細胞可以聯合使用排除法和陽性選擇法來進行分離。現在還可以根據細胞的胞漿蛋白或活性細胞的分泌蛋白來進行細胞分離。

  磁性細胞分選有兩種常用方法:陽性選擇法及排除法。陽性選擇法是指把目的細胞標記后直接把它們作為陽性的磁性標記的組分分選出來;排除法是指把非目的細胞標記,然後把它們從細胞混合物中去除掉。在後一種情況下,我們主要是要得到非磁性標記的組分。對於不同的實驗要按具體情況來決定是用陽性選擇法還是用排除法。從異質性細胞的懸液中分離目的細胞最直接的方法就是先把目的細胞特異性標記后把它們分離出來。因為磁珠與細胞表面的結合很少會影響細胞的功能和存活力,所以應首先考慮陽性選擇法。用陽性選擇法具有速度上和單克隆抗體特異性的優勢。在大多數情況下陽性選擇法可以為您節約時間和費用。如果您的實驗不適合用陽性選擇法(例如,細胞可能會被抗體激活,或目的細胞無特異性抗體等),您可以選擇排除法,對非目的細胞進行標記,一次排除過程就可以把99.99%磁性標記的細胞排除掉,從而得到高純度的細胞,

  如果您要分離非常稀少的細胞,可以先把非目的細胞從細胞懸液中排除掉,再對富集后的細胞組分進行陽性選擇,從而獲得高純度的細胞。這種策略也可用於一些非目的細胞也表達有用來陽性選擇目的細胞的抗原時,先去除非目的細胞,再陽性選擇所需細胞。

  幾乎所有單抗或多抗均可用於間接標記。首先用第一抗體標記細胞,這種抗體可以未結合或結合了生物素、熒光素、藻紅蛋白及異藻藍蛋白的,然後用分別結合有抗免疫球蛋白、抗生物素、鏈霉親和素、抗熒光素、抗PE等抗體的微型磁珠,對細胞進行磁性標記。間接標記可同時進行熒光染色兼容,以進行下一步的流式細胞術或顯微鏡分析。一種抗體的混合物可用於同時分離或去除多種類型細胞。間接標記對對磁性標記有放大作用,這可能在使用弱表達標誌進行磁性分離時會很重要。

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