人工染色體

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更新時間: 2013-09-04

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人工染色體(英文:artificial chromosome)指人工構建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統。包括酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)、P1派生人工染色體(PAC)、哺乳動物人工染色體(MAC)和人類遊離人工染色體(HAEC)。人工染色體為基因組圖譜製作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具。

人工染色體人工染色體

人工染色體(英文:artificial chromosome)指人工構建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統。包括酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)、P1派生人工染色體(PAC)、哺乳動物人工染色體(MAC)和人類遊離人工染色體(HAEC)。人工染色體為基因組圖譜製作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具。

人工染色體 -原理
人工染色體細菌人工染色體

天然染色體基本功能單位包括複製起始點(replication origin)、著絲粒(centromere)和端粒(telomere)。複製起始點,保證了染色體複製,著絲粒保證了染色體分離,端粒封閉了染色體末端,防止粘附到其他斷裂端,保證了染色體的穩定存在。

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BAC和PAC是用於原核生物大腸桿菌內的人工染色體。BAC是以F因子(fetility factor)為基礎構建的環形質粒,容量為~300kb,而PAC則以F因子和P1噬菌體(P1 phage)為基礎構建的環形質粒,容量為130-150kb。它們不是嚴格意義上的人工染色體,因為它們不含著絲粒和端粒。YAC是酵母人工染色體,它含有著絲粒,複製原點和端粒,能穩定遺傳,其容量在100-2000kb。在染色體區帶構建YAC重疊群,促進了大規模基因組測序和致病基因的克隆。類似於YAC的MAC尚在研究之中,它含有哺乳動物染色體基本功能單位。如果研究成功,可能成為很好的基因治療載體和轉基因動物載體。

HAEC是基於人類EB病毒而構建的環形DNA,含有EB病毒的複製原點(oriP)和潮黴素抗性基因。能以環形小染色體形式複製,並在有絲分裂中保持穩定。HAEC可能會成為基因治療的重要載體。

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人們為了克隆大片段DNA,利用DNA體外重組技術分離了天然染色體的基本功能元件並將它們連接起來,從而構成了人工染色體。相比於其他複製子而言,染色體要大得多。

人工染色體 -構建
人工染色體酵母人工染色體

1983年,美國的Dana-Farber癌症研究所和哈佛大學醫學院的教授首次在Nature上發表文章,報道了構建YAC(Yeast Artificial Chromosome)庫的過程。1987年,Burke等人發現,僅僅帶有ARS序列的載體雖然能夠被複制,但極易在有絲分裂時丟失。即使在選擇培養基上,也只有5%-20%的子代細胞帶有ARS載體。加入Centromeres (CEN)能顯著提高ARS質粒在有絲分裂時的穩定性,90%以上子代細胞帶有該載體。CEN還能顯著降低拷貝數,從20-50/細胞降為1-2/細胞.(Science, 236:806-812)。

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人工染色體含有三種必需成分:著絲粒,端粒和複製起點。著絲粒(CEN)位於染色體中央,呈紐扣狀結構,在有絲分裂時結合微管並調控染色體的運動,也是姐妹染色單體配對時的最後位點,接收細胞信號而使姐妹染色體分開。端粒(TEL):主要功能是防止染色體融合,降解,確保其完整複製。端粒酶以其自身RNA為模板,在染色體端部添加上端粒重複序列,並參與端粒長度和細胞增殖的調控。

複製起點:DNA複製通常由起始蛋白與特定的DNA序列相互作用開始。DNA合成的起始位點和DNA複製起點(遺傳位點)所需的Cis靶區常位於同一段長約100bp的DNA上。

YAC的主要缺點
1.存在高比例的嵌合體,即一個YAC克隆含有兩個本來不相連的獨立片段;
2.部分克隆子不穩定,在轉代培養中可能會發生缺失或重排;
3.難與酵母染色體區分開,因為YAC與酵母染色體具有相似的結構;
4.操作時容易發生染色體機械切割;
以細菌寄主系統為基礎的克隆載體形成嵌合體的頻率較低,轉化效率高,又易於分離。科學家用「染色體建造」法用F質粒及其調控基因構建細菌載體,克隆大片段DNA。該質粒主要包括oriS, repE(控制F質粒複製)和parA, parB(控制拷貝數)等成分。

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BAC的優點
1. 易於用電擊法轉化E.coli(轉化效率比轉化酵母高10-100倍);
2. 超螺旋環狀載體,易於操作;
3. F'質粒本身所帶的基因控制了質粒的複製;
4. 很少發生體內重排。
有人把人類染色體端粒DNA上單個α-衛星DNA單元多聚化形成1Mb左右的大片段並與人類基因組DNA混合,產生了能被複制,能正常分裂並得到長期穩定保存的人工合成的染色體,長度約為6-10Mb,稱為MAC或HAC。

人工染色體 -常用載體

一、酵母人工染色體(Yeast artificial chromosomes YACs)

(圖)PYAC4 遺傳結構圖PYAC4 遺傳結構圖

YAC 人工染色體載體是利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色體的複製元件構建的載體,其工作環境也是在釀酒酵母中。釀酒酵母的形態為扁圓形和卵形,生長的代時為 90 分鐘;含 16 條染色體,其大小為 225-1900kb ,總計有14×106 bp;具真核 mRNA 的加工活性。

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1.YAC人工染色體載體的複製元件和標記基因
在 YAC 載體中最常用的是 pYAC4 。由於酵母的染色體是線狀的,因此其在工作狀態也是線狀的。但是,為了方便製備YAC載體, YAC 載體以環狀的方式存在,並增加了普通大腸桿菌質粒載體的複製元件和選擇標記,以便保存和增殖。

YAC 載體的複製元件是其核心組成成分,其在酵母中複製的必需元件包括複製起點序列即自主複製序列(autonomously replicating sequence, ARS)、用於有絲分裂和減數分裂功能的著絲粒 (centromere , CEN)和兩個端粒(TEL)。

YAC 載體為能夠滿足自主複製、染色體在子代細胞間的分離及保持染色體穩定的需要,必須含有以下元件:
·端粒重複序列(telomeric repeat , TEL):定位於染色體末端一段序列,用於保護線狀的 DNA 不被胞內的核酸酶降解,以形成穩定的結構。
·著絲粒(centromere , CEN):有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點, 使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中 。在 YAC 中起到保證一個細胞內只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。
·自主複製序列(autonomously replication sequences,ARS) 一段特殊的序列,含有酵母菌中 DNA 進行雙向複製所必須的信號。

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YAC 載體的選擇標記主要採用營養缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等,以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養基上形成紅色菌落,當帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在於細胞中時,可抑制 ade 2-1基因的突變效應,形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉變的現象,可用於篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。

2.YAC 載體的工作原理
YAC 載體主要是用來構建大片段 DNA 文庫,特別用來構建高等真核生物的基因組文庫,並不用作常規的基因克隆。當用 BamHⅠ 切割成線狀后,就形成了一個微型酵母染色體,包含染色體複製的必要順式元件,如自主複製序列、著絲粒和位於兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅動染色體的複製和分配,從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。對於 BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色體,當用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 內部的位點后形成染色體的兩條臂,與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體,通過轉化進入到酵母菌后可象染色體一樣複製,並隨細胞分裂分配到子細胞中去,達到克隆大片段DNA 的目的。裝載了外源 DNA 片段的重組子導致抑制基因 sup4 插入失活,從而形成紅色菌落; 而載體自身連接後轉入到酵母細胞后形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源 DNA 片段的重組酵母菌菌落的群體就構成了 YAC 文庫。 YAC 文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達 200-500kb,有的可達 1Mb 以上,甚至達到 2Mb 。

YAC 載體功能強大,但有一些弊端。這主要表現在 3 個方面:首先,在 YAC 載體的插入片段會出現缺失 (deletion) 和基因重排 (rearrangement) 的現象。其次,容易形成嵌合體。嵌合就是在單個 YAC 中的插入片段由 2 個或多個的獨立基因組片段連接組成。嵌合克隆約佔總克隆的 5%~50% 。最後, YAC 染色體與宿主細胞的染色體大小相近,影響了 YAC 載體的廣泛應用。 YAC 染色體一旦進入釀酒酵母細胞,由於其大小與內源的染色體的大小相近,就很難從中分離出來,不利於進一步分析。但是 YAC 的一個突出優點是,酵母細胞比大腸桿菌對不穩定的、重複的和極端的 DNA 有更強的容忍性。另外, YAC 在功能基因和基因組研究中是一個非常有用的工具。由於高等真核生物的基因大多數是多外顯子結構並且有長長的內含子,大型基因組片段可通過 YAC 載體轉移到動物或動物細胞系中,進行功能研究。

二、細菌人工染色體載體(Bacterial artificial chromosomes,BACS)
1.F 質粒
大腸桿菌的 F 因子是一個約 100kb 的質粒。它編碼60多種參與複製、分配和接合過程的蛋白質(Willetts and Skurray,1987)。雖然F因子通常以雙鏈閉環DNA(1-2個拷貝/細胞)的形式存在,但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個位點處進行隨機整合(Low,1987)。攜帶F因子的細胞,或以遊離狀態或以整合狀態表達三根發樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細胞之間產生性接觸所必需。

2.細菌人工染色體
是基於大腸桿菌的 F 質粒構建的,高通量低拷貝的質粒載體。每個環狀 DNA 分子中攜帶一個抗生素抗性標記,一個來源於大腸桿菌 F 因子(致育因子)的嚴謹型控制的複製子 oriS ( Shizuya et al. 1992 ),一個易於 DNA 複製的由 ATP 驅動的解旋酶( (RepE) 以及三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因座 ( parA , parB , 和 parC ) 。 BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產生,減小外源基因的表達產物對宿主細胞的毒副作用。

第一代 BAC 載體 (Shizuya et al. 1992) 不含那些能夠用於區分攜帶重組子的抗生素抗性細菌菌落與攜帶空載體的細菌菌落的標記物。新型的 BAC 載體可以通過α互補的原理篩選含有插入片段的重組子,並設計了用於回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位點和用於克隆 DNA 測序的 Sp6 啟動子、 T7 啟動子 (Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997) 。 Not Ⅰ 識別序列,位點十分稀少。重組子通過 Not Ⅰ 消化后,可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是來源於噬菌體的啟動子,用於插入片段末端測序。圖 3-28 是 pBeloBAC11 遺傳結構圖。

BAC 與 YAC 和 PAC(P1 artificial chromosomes , P1 人工染色體 ) 相似,沒有包裝限制,因此可接受的基因組 DNA 大小也沒有固定的限制。大多數 BAC 文庫中克隆的平均大小約 120kb ,然而個別的 BAC 重組子中含有的基因組 DNA 最大可達 300kb 。

F 質粒能夠編碼形成性菌的蛋白,通過大腸桿菌的結合轉移可以進行遺傳物質的轉移。但是基因操作的時候一般不用這種自發的轉化方式。 BAC 載體空載時大小約 7.5kb ,在大腸桿菌中以質粒的形式複製,具有一個氯黴素抗性基因。外源基因組 DNA 片段可以通過酶切、連接克隆到 BAC 載體多克隆位點上,通過電穿孔的方法將連接產物導入大腸桿菌重組缺陷型菌株。裝載外源 DNA 后的重組質粒通過氯黴素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互補篩選。

三、P1 噬菌體載體和 P1 人工染色體載體

1.P1 噬菌體載體(Bacteriophage P1 vectors)
是 Sternberg 基於 P1 噬菌體構建的,與黏粒載體工作原理比較相似的一種高通量載體。它含有很多 P1 噬菌體來源的順式作用元件,能容納 70~100kb 大小的基因組DNA片段(Sternberg 1990, 1992, 1994) 。在這種系統中,含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到 P1 噬菌體顆粒中,後者總容量可達 115kb (包括載體和插入片段)。將重組 DNA 注射到表達 Cre 重組酶的大腸桿菌中,線狀 DNA 分子通過重組於載體的兩個 loxP 位點之間而發生環化。另外,載體還攜帶一個通用的選擇標記 kan r ,一個區分攜帶外源 DNA 克隆的陽性標記 sacB 以及一個能夠使每個細胞都含有約一個拷貝環狀重組質粒的 P1 質粒複製子。另一個 P1 複製子( P1 裂解性複製子)在可誘導的 lac 啟動子(IPTG 誘導)控制下,用於 DNA 分離前質粒的擴增。圖 3-29 是 P1 噬菌體載體 pAd10sacBII 的遺傳結構圖。

2.P1 人工染色體(P1 artificial chromosomes)
結合了 P1 載體和 BAC 載體的最佳特性,包括陽性選擇標記 sacB 及噬菌體 P1 的質粒複製子和裂解性複製子。然而除了將連接產物包裝進入噬菌體顆粒以及在 cre-loxP 位點使用位點特異性重組產生質粒分子以外,在載體連接過程中產生的環狀重組 PAC 也可能用電穿孔的方法導入大腸桿菌中,並且以單拷貝質粒狀態維持 (Ioannou et al. 1994) 。基於 PAC 的人類基因組文庫插入片段的大小在 60kb~150kb 之間。

人工染色體 -歷史事件
人工染色體人工染色體

2002年KurofwaY構建成功的轉染色體牛,也是在利用構建人人工染色體技術形成的,HAC外周血淋巴細胞中的存留率為91%,遠遠高於HAC在鼠體內的存留率。

在1995年已利用STS構建了225個酵母人工染色體(YAC)連續克隆重疊群組成的、覆蓋範圍達整個人類基因組75%的第一代物理圖譜。

因此到了1992年,Shizuya等發展了細菌人工染色體(BAC)作為構建基因組文庫的載體,BAC質粒以大腸桿菌為宿主,克服了YAC載體的不足之處,同時BAC質粒外源插入片段可達150kb上,能滿足物理圖譜的構建、染色體的步查等基因組的研究,因而逐漸取代YAC載體成為基因組文庫構建的首選載體。

1992年底,陳竺赴法國巴黎人類多態性研究中心拷貝酵母人工染色體基因文庫(YAC文庫)這是該中心在1992年人類基因組國際會議上宣布贈送給上海第二醫科大學陳竺領銜的血液分子生物學實驗室的,至此,中國成為世界上第四個擁有此國際最先進基因庫的國家。

1990年:科學家研究出細菌人工染色體;1990年,在人類基因組工程啟動的同時,研究人員也開始研究如何製造高效穩定的大分子DNA載體—細菌人工染色體(BAC)載體。

1987年,Burke和lson以自主複製序列(ARS)著絲點序列(CEN)和端粒序列(TEL)為基礎,加入可在大腸桿菌中行使功能的複製起點(ORI)以及在酵母細胞中的選擇標記,成功地構建了酵母人工染色體(YAC)並以此作為克隆運載體與高分子量外源DNA連接,轉化酵母細胞。

隨著1983年Murray等將酵母菌染色體著絲粒、自主複製序列和端粒連接在一個載體上,構建了第一個酵母人工染色體(YAC)美國華盛頓大學Burke等構建了一個YAC載體,首次將人的DNA大片段插入YAc載體,並導入宿主菌一酵母菌,才使構建覆蓋基因組的物理圖譜和圖位克隆基因成為可能。

自1983年由Murray等人首次成功構建了酵母人工染色體(YAC)以來,人工染色體的研究受到科學家們的廣泛關注,並取得迅速發展,人工染色體在基因組分析,基因功能鑒定,基因治療及染色體結構與功能關係的研究等方面具有重要意義。

1983年。酵母人工染色體構建成功,14年後,第一個HAC的成功構建,被認為是基因治療載體研究領域的重大突破。

1980年,李炳林教授等用亞洲棉與比克氏棉進行雜交,得到異源二倍體雜種,經人工染色體加倍,獲得可育的異源四倍體。

1974年所得214株綠色小苗,大多數生長健壯,經人工染色體加倍處理后,移栽於溫室中,進行管理和觀察,現生長良好,有18個株系已開花結實,已得種子近136粒。

1973年所得39株綠苗,有37株栽培長大,其中32株經人工染色體加倍處理后,有6株正常結實,共收穫種子37粒,現已再次播種繁殖。

人工染色體 -參考資料

[1] 310086 http://www.310086.com/view/Zxrt0xXkqGY=

[2] 南湖教苑 http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/jycz/skja/three_05.htm

[3] 學術趨勢 http://trend.cnki.net/trendshow.php?searchword=%E4%BA%BA%E5%B7%A5%E6%9F%93%E8%89%B2%E4%BD%93

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