乙肝免疫學細胞機理

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更新時間: 2013-08-28

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通過分析乙型肝炎免疫細胞化學、肝硬變免疫細胞化學、肝癌免疫細胞化學解讀乙肝免疫學細胞機理。

乙肝免疫學細胞機理 -乙型肝炎免疫細胞化學

  乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的傳染病。乙型肝炎的發病是乙型肝炎病毒與機體之間相互作用的結果。目前研究證明,乙型肝炎病毒並非直接引起肝細胞的損傷,而是由於人體感染乙型肝炎病毒后,引起細胞免疫和體液免疫的應答。因此,人們認為機體免疫應答是引起肝細胞損害的重要原因。乙型肝炎病毒侵入機體后,在肝細胞內進行複製繁殖。乙型肝炎病毒基因組DNA在肝細胞核內進行複製,轉錄,在合成核心顆粒后,被轉運到肝細胞漿內,在通過內質網和細胞膜時合成其外殼部分,並以發芽的形式釋放出肝細胞。Dane 顆粒的核心部分含有核心抗原(HBcAg),細胞核內較多,尤其是免疫抑制者更明顯。在血清中,HbcAg總是與核心抗體(抗-HBc)形成複合物。故在循環血液中不存在遊離的核心顆粒。Dane顆粒的外殼部分含有表面抗原(HBsAg),在釋出肝細胞過程中裝配上有肝細胞成分。HBcAg 和HBsAg都能引起細胞免疫及體液免疫反應,特別是HBsAg誘發的免疫反應可以引起肝細胞的損害,以細胞免疫反應起主要作用。近年來,對乙型肝炎病毒分子生物學研究證明,HBV基因組有4個可被轉錄的區域(或4個開放讀框),稱S,C,P和X區。S區又進一步分為前S1(pre-S1)前S2(pre-S2)和S基因區,主要為組成病毒外殼的三種不同的蛋白編碼。前S1和前S2區肽段被認為和病毒對肝細胞的附著有關。目前已明確,HBV有5種抗原表達即HBsAg前S1,前S2,HBcAg(包括HBeAg)和HBxAg。它們在體內均可產生相應的抗體,發生免疫反應。

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(一)乙型肝炎的免疫反應發病機理

  人體感染乙型肝炎病毒后,可引起細胞免疫及體液免疫應答,並激發自身免疫反應及免疫調節 功能紊亂,致使病變的肝細胞產生或釋放大量正常或異常的蛋白質,進一步促使免疫損害加重,使病情不斷發展。

  1.體液免疫反應在乙型肝炎發病中的作用體內發生HBV感染后,可以產生各種抗原,這些抗原激發機體免疫系統而產生相應的抗體,如抗-HBs,抗-HBc,抗-HBe,抗-HBs1,抗-HBs2和抗-HBx等。這些抗體能對血中的乙型肝炎病毒進行反應加以殺滅。乙型肝炎病毒抗原大多位於胞漿內(HBcAg主要位於核內),部分亦位於胞膜上及核內。因此在抗原抗體發生免疫反應過程中,受病毒感染過的肝細胞亦遭到攻擊,使肝細胞受到損害。近來有人報道在肝細胞膜上存在著兩種不同的受體:一種受體是能直接和前S1抗原結合,另一種受體是通過多聚人血清白蛋白(PHSA)與前S2抗原結合。前S1或S2抗體出現於HBV感染的早期血清內,具有中和病毒及阻斷抗原和肝細胞結合的作用,在抗原抗體發生免疫反應過程中引起肝細胞的損傷。抗原和抗體之間量的不平衡程度決定了乙型青炎病變的程度。當抗原抗體過多時,則出現大量的抗原抗體複合物,可導致暴髮型肝炎;當抗原量少,體內產生的抗體可以逐漸清除抗原,則表現為普遍型肝炎;當體內產生的抗體不足以清除抗原時出現抗原過剩,則表現為慢性肝炎;當HBV進入機體后,機體不產生的抗體,無臨床癥狀,則為健康帶毒者。目前研究認為,無球蛋白血症的患者(基本上無體液免疫反應),不僅可以發生慢性肝炎,亦可以發生急性肝炎;有些乙型肝炎患者血清中抗原抗體複合物的含量與肝細胞損害的程度不一致,因此,乙型肝炎病毒對肝細胞的損害並非完全通過體液免疫反應。

  2.細胞免疫反應在乙型肝炎發病中的作用目前研究認為,細胞免疫反應是乙型肝炎病毒感染后引起肝細胞損害的主要機理。細胞免疫反應是通過殺傷性T細胞(K細胞),自然殺傷細胞(NK細胞)及抗體依賴細胞毒作用而發生。近來研究表明,在細胞免疫反應中,靶細胞抗原包括HBsAg,HBcAg,pre –S1,pre-S2及LSP(肝細胞膜脂蛋白)等。一般來說,急性肝炎靶細胞抗原可能主要為HBcAg,pre-S2,慢性活動性肝炎可能為HBcAg及LSP。近年來研究表明,HBcAg除位於肝細胞核內,也位於胞漿內及胞膜上。HBcAg位於細胞膜表面,可提供為T細胞毒的靶抗原,而且血清中抗-HBc可以和特異性細胞毒性T細胞競爭結合在肝細胞膜上的HBcAg,阻斷T細胞的攻擊。有人提出,HBcAg的免疫應答對HBV感染有保護作用。有人研究證明,在肝細胞膜上有HBcAg 表達者,細胞毒試驗為陽性,且可被抗-HBc封閉,用抗-HBs無效。這表明位於肝細胞膜表面的HBcAg為T細胞的靶抗原。亦有人提出在肝細胞膜上僅有HBsAg,而未發現HBcAg或HbeAg,因此認為HBsAg也是T細胞的靶抗原。在細胞免疫反應中,T細胞要求對靶細胞的特異性抗原和組織相容性抗原(HLA)的雙重識別。HBeAg陽性的乙型肝炎患者,肝細胞膜上HLA僅為輕度陽性,而抗-HBe陽性患者則顯著增強,提高T細胞清除感染細胞的作用,這可能為干擾素抗病毒的療效機制之一。在細胞免疫反應中,T細胞除細胞毒效應外,還有淋巴因子效應。致敏的淋巴細胞可以釋放各種淋巴因子,如淋巴毒素、細胞毒因子、趨化因子、巨噬細胞移動抑制因子、轉移因子等。有人發現淋巴因子可以引起肝細胞廣泛壞死,呈小葉中央性或中間帶分佈。NK細胞在乙型肝炎發病機理中的作用仍不太清楚,亦可能參與細胞免疫反應的調節作用。由於細胞免疫反應的不同,就出現不同類型的肝炎,表現不同的臨床病理特點。如T細胞功能正常,感染病毒量多,毒力強,受感染的肝細胞多而嚴重,則受到免疫損傷的肝細胞多而且重,表現為急性重型(暴髮型)肝炎;如果感染病毒量少,毒力較弱,則發生急性普通型肝炎;如果病毒量很少,毒力很弱,則表現為輕型或亞臨床肝炎。如果T細胞呈免疫耐受狀態或機體免疫機能缺陷,病毒與宿主共生,病毒在肝細胞內不斷複製,感染的肝細胞不發生免疫損,則表現為無癥狀病毒攜帶者。如果在T細胞功能不足,免疫反應僅能清除部分病毒及部分肝細胞受到免疫損傷,未被清除的病毒可以反覆感染肝細胞並進行複製,於是不斷出現肝細胞的損害,表現為慢性肝炎,特別是慢性活動性肝炎。

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(二)乙型肝炎與自身免疫反應

  正常人由於T細胞對自身抗體系統的調控,在清除老化或破壞的肝細胞時,雖可產生自身抗體,但並不發生自身免疫性疾病。在慢性肝炎,特別是慢性活動性肝炎時,由於T細胞免疫機能缺陷,乙型肝炎抗原(包括HBsAg,HBcAg及HBeAg)與宿主肝細胞表面或內部的蛋白質相互作用,形成含自身組織蛋白的抗原,具有較強的免疫原性,可引起持續的自身免疫反應;也可能由於病毒使機體免疫系統穩定性發生紊亂,細胞免疫失去調控,體液免疫反應亢進,對宿主的自身組織產生抗體,發生自身組織免疫反應,引起肝細胞損傷。有研究表明,慢性活動性肝炎的患者出現對肝細胞表面肝特異性脂蛋白的特異性細胞免疫反應。有人報道,根據肝炎患者肝細胞上免疫球蛋白的沉積,提示存在與HBsAg無關的自身免疫機理。有人認為,肝炎患者病毒性損傷可釋放肝特異抗原,使宿主致敏,並使肝損傷持續存在。因此,自身免疫反應在慢性活動性肝炎發病中具有一定的作用。目前已知在慢性活動性肝炎患者常出現某些自身免疫現象,如常伴有關節 炎、皮疹、腎小球腎炎、慢性甲狀腺炎及乾燥綜合症等自身免疫性疾病,患者血清中IgG、IgA及IgM明顯升高,血清中可查到抗平滑肌抗體、抗核抗體、抗線粒體抗體、抗肝細胞膜特異性脂蛋白抗體及類風濕因子等自身抗體;有15~30%的患者可查到狼瘡細胞。

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(三)乙肝肝細胞內病毒抗原的定位及分佈

  近年來,對乙型肝炎病毒(HBV)分子生物學研究表明,HBV基因組有四個開放讀框(Open reading frame, ORF),其中S基因區能編碼HBV外殼的結構蛋白,即小S蛋白(主蛋白,HBsAg),中等S蛋白(前S2抗原)和大S蛋白(前S1抗原),它們都具有較高的免疫原性。P區編碼具有反轉錄酶活性的病毒DNA多聚酶。X區編碼145至154個氨基酸的多肽,編碼蛋白為HBxAg。C區編碼HBV的核心部分,即HBcAg 和HBeAg。目前通過免疫組化及免疫電鏡等技術均可觀察到HBV各種抗原在肝細胞定位及分佈狀態。

  1.HBsAg pre –S1,pre-S2在肝細胞內的分佈HBsAg ,前S1和前S2抗原在乙型肝炎,特別是慢性活動性肝炎的肝細胞內檢出率為52~65%。HBsAg ,前S1和前S2抗原陽性經常出現於同一部位,甚至同一細胞內。前S1陽性反應比HBsAg和前S2強。有的病例三者並非同時出現,並非在同一位置。少數情況下,HBsAg 陽性,而前S1和前S2陰性,反之,HBsAg 陰性,而前S1和S2陽性;絕大多數情況下前S1和前S2並存在同一部位或同一細胞之內,少數情況下,HBsAg ,前S1陽性而前S2弱陽性或陰性。HBsAg、前S1和前S2抗原主要位於乙肝的肝細胞漿內,部分位於胞膜上,少數位於胞核內。HBsAg ,前S1和前S2抗原陽性物質在肝細胞內的分佈大致有三種形態:①包涵體型:陽性物質聚集成團塊狀,輪廓清楚,呈圓形或卵圓形,位於核的一側,或者只佔據胞漿的小部分,或佔據胞漿的大部分,將核推向一側,此型最為多見;②全胞漿型或瀰漫型:陽性物質均勻分佈於肝細胞的胞漿內,核往往為陰性位於中央,此型亦較常見;③胞膜型或周邊型:陽性物質沿著胞膜或胞膜內側分佈,有人把胞膜型再分為胞膜抗原I型和II型,前者主要表現為S抗原聚集在肝竇側的肝細胞膜上,呈線條狀排列;後者主要累及整個肝細胞膜,呈顆粒狀或串珠排列。上述S抗原在肝細胞內分佈的三種類型往往是兩者或三者聯合出現,只是以某一種為主而已,單獨存在者少見。S抗原陽性細胞的分佈有三種類型:1)散在型,在切片中只見少數散在的陽性細胞,此型多見於慢性遷延性肝炎或靜止期肝硬變組織內;2)局灶型,陽性細胞呈簇分佈於切片的某一區域,此型多見於急性輕型肝炎或慢性活動性肝炎的組織內;3)瀰漫型,多數陽性細胞瀰漫分佈於切片內,此型多見於慢性活動性肝炎,急性重型肝炎或肝硬變的整個結節 內。不同病例S抗原反應強度及陽性細胞檢出率是不同的,就是同一病例不同部位也不盡相同。S抗原陽性物質反應的強弱取決於S抗原的含量。

  2.HBcAg 和HBeAg在肝細胞內分佈HBcAg多見於乙型肝炎、肝硬變的肝細胞內,特別是腎臟移植病人,有內HBcAg檢出率特別高。一般來說,在慢性肝炎HBcAg的檢出率在10%~30%不等,其檢出率明顯低於HBsAg。這可能是由於HBcAg和抗-HBc在核內形成免疫複合物,HBcAg被封閉之故。HBcAg多位於肝細胞的胞核內,少數位於胞漿內及胞膜上。HBcAg陽性物質位於核內常呈細顆粒狀均勻分佈,少數為斑點狀或網狀;而在胞漿內則為細顆粒狀或絮狀;在胞膜上則為均勻細顆粒狀。經常出現的是以核型、漿型和膜型同時存在於一個肝細胞內,亦可單獨存在。HBcAg陽性肝細胞的分佈和HBsAg相似,亦分散在型、局灶型和瀰漫型。局灶型經常見於慢性活動性肝炎;瀰漫型經常見於腎移植的肝;散在型經常見於急性肝炎或遷延性肝炎。HBeAg陽性物質在肝細胞內的分佈狀態與HBcAg相似。HBeAg 和HBcAg經常位於同一細胞核內,用羅達明標記雙染色證明HBcAg和HBeAg之間有密切關係。HBeAg陽性主要見於HBsAg陽性的慢性活動性肝炎的肝細胞內。

  3.HBxAg在肝細胞內分佈HBxAg經常見於慢性肝炎的肝細胞內,其檢出率為65%左右,比HBcAg和HBsAg高。特別在慢性活動性肝炎檢出率更高,約73%;而慢性遷延性肝炎則為43%左右。HBxAg陽性物質為均勻細顆粒狀,主要位於肝細胞的胞漿內,少數位於胞核內及胞膜上。不同病例HBxAg陽性物質的分佈及陽性反應強度不同,就是同一病例不同部位其結果亦不盡相同。HBxAg陽性肝細胞的分佈狀態和HBsAg相似,亦呈散在型,局灶型和瀰漫型。在慢性活動性肝炎以局灶型多見,其次為瀰漫型。有些病例,HBxAg陽性細胞圍繞小血管分佈,有的則沿著纖維隔分佈。HBxAg陽性物質亦見於少數肝內膽管上皮內及Kupffer細胞內。

  4.IgG(抗-HBc)在肝細胞內分佈用免疫熒光及免疫酶技術證實在肝炎組織中存在Igg ,這種IgG 可能就是抗-HBc,該抗體經常和HBcAg以複合物的形式存在於肝細胞核內,少數也見於胞漿內及胞膜上。Rey(1979)還證明這些IgG只見於含有HBcAg 的肝細胞核內。IgG(抗-HBc)陽性物質的分佈及其陽性細胞的分佈同HBcAg。

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乙肝免疫學細胞機理 -肝硬變免疫細胞化學

  肝硬變或稱肝硬化(liver cirrhosis)是多種原因引起的慢性肝臟疾病,其中原因之一是和HBV慢性感染有關,特別在中國HBV可能是引起肝硬變的主要原因。HBV感染引起乙型肝炎,部分病例變成慢性活動性肝炎,進而轉變成肝硬變。其中大部分為門脈性肝硬變(小結節 型肝硬變),小部分為壞死後性肝硬變(大結節 型肝硬變)。近年來在中國通過臨床、病理及免疫病理的研究證明,HBV感染與肝硬變的發生有十分密切關係,在肝硬變內HBsAg檢出率為70%~90%。世界其它一些國家和地區,如日本、印度、非洲、香港等也有類似的報道。肝硬變的發生可能是由於機體免疫機能不足,不能將HBV完全殺滅和排除。在機體內HBV不斷複製繁殖,並通過免疫機制使肝細胞反覆遭受破壞,以及肝細胞結節 狀再生,纖維組織不斷增生,形成纖維隔,致使正常的肝小葉結構破壞,最後形成肝硬變。下面用免疫細胞化學(PAP),親合免疫細胞化學(ABC)等方法對HBV抗原、纖維結合蛋白(FN)、III型膠原和細胞角蛋白在肝硬變組織內定位及分佈進行描述。

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(一)肝硬變組織內HBV抗原的定位及分佈

  用免疫細胞化學(PAP)及免疫親合素(ABC)方法在肝硬變組織內對HBV抗原(HBsAg ,pre –S1,pre-S2,HBcAg HBxAg)進行了檢測,觀察了它們在肝細胞,kupffer 細胞內等定位和其分佈狀態。

  1.HBsAg 、pre –S1和pre-S2在肝細胞內分佈HBsAg在肝硬變組織中檢測率為70%~80%,其中86%伴有肝細胞不典型增生;pre –S1和pre-S2的檢出率為60%~70%,其中84%伴有肝細胞不典型增生。HBsAg 、pre –S1和pre-S2抗原經常出現於肝硬變組織的同一部位,甚至同一細胞內。少數情況下,HBsAg陽性,而pre –S1或pre-S2陰性,反之,HBsAg 陰性,而pre –S1或pre-S2陽性。HBsAg 、pre –S1和pre-S2抗原主要位於肝細胞漿內,部分位於膜上,少數位於核內。在部分肝硬變病例中,HBsAg 、pre –S1和pre-S2在也見於kupffer細胞內及肝內膽管上皮細胞內。

  2.HBcAg 在肝細胞內的分佈HBcAg 在肝硬變組織內的檢出率為20%左右,其中82%伴有肝細胞不典型增生。HBcAg 陽性檢出率明顯低於HBsAg 、pre –S1和pre-S2,這可能是由於HBcAg 和抗-HBc在核內形成免疫複合物,以至HBcAg 被封閉之故。HBcAg 主要位於肝細胞核內的形態表現為分佈與肝炎的相似。在少數病例HBcAg 陽性物質也見於匯管區的纖維組織內及肝竇壁上。

  3.HBxAg 在肝細胞內的分佈HBxAg在硬變組織的檢出率為80%左右,其中85%伴有肝細胞不典型增生。HBxAg的檢出率和HBsAg相似。HBxAg陽性物質呈細顆粒狀。主要位於肝細胞漿內,少數位於胞核內及胞膜上。HBxAg在肝細胞內的形態表現及陽性細胞的分佈狀態與HBsAg相似。有部分病例HBxAg沿著肝硬變的纖維隔分佈。HBxAg陽性物質也見於肝內膽管上皮細胞及kupper細胞內。

  4.IgG(抗—HBc )在肝細胞內的分佈在肝硬變組織內可觀察到抗-HBc的存在,其陽性率與HBcAg相似。該抗體經常和HBcAg以複合物的形式存在於肝細胞核內,少數也見於胞漿內及膜上。抗-HBc陽性物質在肝硬變細胞內的存在和陽性細胞的分佈狀態與HBcAg相同。

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(二)肝硬變纖維結合蛋白的定位及分佈

  纖維結合蛋白(fibronectin, FN)是一個非膠原性的大分子糖蛋白。近年來研究發現它與損傷修復及器官硬化有密切關係。在肝硬變及慢活肝的組織內FN沉積增加,可能與肝硬變時纖維組織隔形成有關係。在肝硬變組織內,FN陽性物質位於肝細胞內及kupffer細胞內,其陽率分別為59%、65%。FN陽性物質瀰漫分佈於胞漿內,陽性細胞多呈三五成群地分佈於假小葉邊緣、中央靜脈旁及肝實質內灶(片)狀杯死區域的附近。匯管區及纖維隔內可見數量不等的FN陽性的組織細胞和纖維母細胞。此外。有的病例肝竇壁、血管內皮及小膽管基底膜也呈陽性反應。FN陽性檢出率和HBsAg陽性呈正相關,在FN陽性病例中有80%HBsAg陽性。而活動性肝硬變FN陽性明顯高於非活動性肝硬變(P<0.01)。上述結果表明,在由HBV感染引起的肝硬變過程中,FN參與了肝硬變的形成。

(三)肝硬變組織內III型膠原的定位及分佈

  在肝硬變時,I、III型膠原增加,這與肝纖維化有密切關係。實驗結果證明,在慚性遷延性肝炎→慢性活動性肝炎→肝硬變之間,Ⅰ、Ⅲ型膠原的分佈呈逐漸增加的趨勢。除匯管區Ⅰ、Ⅲ型膠原增多外,中央靜脈周圍及小葉內壞死區、炎症區也增多,形成小葉內纖維化與從匯管伸向小葉內纖維組織相連形成纖維隔。在部分肝硬變病例,肝細胞內有Ⅲ型膠原陽性反應。在纖維隔及假小葉的竇壁上Ⅲ型膠原陽性率為100%,在肝細胞內為34%。Ⅲ型膠原在寬大纖維隔內呈瀰漫密集分佈,在竇壁上為連續線狀分佈,在肝細胞漿內呈瀰漫分佈。陽性肝細胞主要位於小葉邊緣或近纖維隔處。動物實驗證明Ⅰ、Ⅲ膠原是由肝細胞合成產生的,並參與肝硬變的形成。

(四)肝硬變組織內角蛋白定位及分佈

  在正常肝臟中肝細胞和膽管上皮細胞各有其特徵性的細胞角蛋白(CK)組型,它們是各自形態發生的過程中建立的。研究結果表明在肝硬變組織中有81%呈角蛋白陽性反應,但陽性反應程度各病例是不相同的。CK陽性的肝細胞主要位於匯管區周圍。尤其是碎屑狀肝細胞壞死附近,並常伴有肝細胞小管狀化生、弧立肝細胞團塊形成及膽管或膽小管增生,它們之間在細胞形態和陽性強度上有移行關係,有的病例整個假小葉CK陽性。部分肝小多角型細胞也呈陽性反應。在肝硬變組織內CK陽性反應與HBsAg陽性呈正相關。CK陽性的肝硬變中絕大多數HBsAg也陽性,這一結果HBV感染所致的慢性肝臟病變可引起CK的異常表達。

乙肝免疫學細胞機理 -三、肝癌免疫細胞化學

  原發性肝細胞癌(簡稱肝癌)是世界上較常見的惡性腫瘤之一,特別在非洲和亞洲一些地區肝癌發病率較高。自從發現乙型肝炎抗原(HBAg)以來,給HBV與肝癌發病關係的研究開闢了新的途徑。近年來用免疫細胞化學技術及分子雜交技術對HBV與肝癌發病關係的研究更加深入和廣泛,並取得一定成果。全世界各地通過大量的流行病學、免疫病理學、分子遺傳學等研究結果表明,HBV感染與肝癌的發病有密切關係,普遍認為HBV是肝癌發病的主要原因。目前尚不完全清楚HBV致癌機理,是具有直接致癌作用或間接致癌作用,這有待進一步研究。

(一)HBV與原發性肝癌的流行病學證據

  HBV與原發性肝癌關係的研究已有20餘年,目前對HBV作為肝癌病因的證據日益增多,特別是對HBV的分子生物學的研究表明,HBV可能具有直接致癌作用。如下事實可作為臨床學和流行病學的證據:

  (1)原發性肝癌常發生在HBV流行區,而非流行區則發病率很低。

  (2)血清學研究表明:生活在HBV流行區的肝癌病人50%~90%HBsAg陽性,而對照組僅為5%~15%;抗-HBc為80%~90%,而對照組為15%~35%。近年來研究表明,肝癌病人抗-GBx的檢出率在85%左右。而對照組很低。些標誌物被認為是目前正在發生HBV感染或先前有HBV持續感染的證據。甚至在歐美肝癌發病率很低的國家,肝癌病人HBsAg,抗-HBc和抗-HBx檢出率也明顯比對照組高。從大量的研究結果表明,在HBV流行區HBV攜帶者肝癌發病的相對危險性比非攜帶者高十倍,甚至幾百倍。

  (3)在HBV流行的人群中,HBV攜帶者與肝癌家庭聚集性的早期觀察,生活早期嬰兒從母親傳播感染是HBV慢性攜帶者,後代亦易成為慢性攜帶者。Larouze 等發現塞內加爾患肝癌的母親中71%HBsAg陽性,而相應的對照組僅為13%,在朝鮮和中國台灣省也觀察到同樣的現象。預防母-嬰的HBV傳播,對預防肝癌的發生具有重要意義,從研究家族病例來看,大多數最終發生肝癌的個體在出生時或是出生后第一年內從攜帶HBV的母親或兄弟姐妹間獲得感染。

  (4)約80%的肝癌病例發生在肝硬變或慢性活動性肝炎的基礎上,而肝硬變和慢性活動性肝炎雙往往由HBV慢性持續性感染引起的。在亞洲和非洲一些地區,肝硬變病人90%以上HBsAg陽性,慢性活動性肝炎病人75%以上HBsAg陽性,而對照組只有6%~14%HBsAg陽性。

(二)肝硬變與肝癌的關係

  大多數肝癌病合併有肝硬變,部分肝硬變病人可發展為肝癌,這一事實早已被人們所注意。大多數報道肝癌合併肝硬變為80%~90%。肝癌合併肝硬變的類型主要為壞死後大結節 型肝硬變,約佔70%~80%,少數為混合型,合併小結節 型肝硬變少見。肝硬變發展為肝癌的百分率,各報道差別較大,但大多數報道為20%左右。壞死後大結節 型肝硬變與乙型肝炎病毒感染有密切關係,HBsAg陽性率很高,達70%~80%。Blumberg等(1977)報道在84例肝硬變中有24例HBsAg陽性,其中6例(25%)發展成肝癌。Obata(1980)指出,HBsAg陽性的肝硬變有23%發生癌變,Nayak(1977)報道,肝硬變發生癌變的機會和其HBsAg陽性有關,HBsAg陽性的肝硬變發生肝癌的機會為51%,而與HBsAg陽性的大結節 型肝硬變有密切關係。大結節 型肝硬變常伴有肝細胞的不典型增生,而伴有不典型增生的肝硬變HBsAg陽性檢出率很高,表明肝細胞不典型增生與HBsAg慢性持續感染有密切關係。有人認為不典型增生的肝細胞是一種癌前期病變。

(三)肝癌及癌周肝組織內HBV抗原的分佈

  目前用組織化學、免疫組織化學及免疫電鏡等技術可以在人肝癌及癌旁肝細胞內檢測到HBsAg、前S1、前S2、HBcAg(HBeAg)及HBxAg等。

  1.肝癌及癌周肝組織內HBsAg定位及分佈在肝癌組織內,HBsAg陽性率一般來說比較低,大多數報道其陽性率在10%~15%,少數報道陽性率可高達25~44%。肝癌細胞內HB-sAg陽性主要見於分化好的肝癌病例,少數亦見於中度分化及分化差的肝癌病例。一般來說,癌周肝組織內HBsAg陽性率明顯高於癌組織。大多數文獻報道,癌周肝組織內HBsAg陽性率為60%~80%,少數報道在90%以上。癌周肝組織內HBsAg陽性主要見於癌周肝硬變中,特別是大結節 肝硬變中。這一結果表明,HBV與肝癌的發生有密切關係。肝癌及癌周肝組織內HBsAg陽性的形態和分佈狀態,不同病例表現不同,就是同一病例不同部位也有很大差異。HBsAg陽性細胞分佈亦不規律。絕大多數HBsAg陽性物質位於胞漿內,部分位於胞膜上,少數位於核內。HBsAg陽性物質呈細顆粒狀、絮狀或網狀。HBsAg陽性物質在細胞內分佈有三種類型:全胞漿型,陽性物質充滿整個胞漿;包涵體型,陽性物質集聚成團,位於核旁一側;胞周型或核周型,陽性物質沿著泡膜或核膜分佈,呈環狀。在肝癌及癌周肝組織內包涵體型或全胞漿型較多見。HBsAg陽性細胞的分佈有三種類型:瀰漫型,多數陽性細胞瀰漫分佈於切片內;局灶型,少數陽性細胞集聚於某一區域;散在型,陽性細胞較少,孤立的或零散的分佈於切片內。一般來說,癌周肝組織HBsAg陽性反應強度和陽性細胞檢出率比癌組織高。癌組織檢出率低的原因,可能是由於癌組織不適於HBsAg的複製,或是由於HBv DNA和宿主DNA發生整合,而HBsAg不易表達所致。至於HBsAg在肝癌發病中的作用,目前尚不清楚。一般認為HBsAg作為靶抗原,通過免疫反應,造成肝細胞的損傷,肝細胞增生,不典型增生,最終可能導致癌變。

  2.肝癌及癌周肝組織內前S抗原的定位及分佈對肝癌及癌周肝組織內前S(pre-S1和pre-S2)抗原的研究遠不及對HBsAg的研究。近來,國內外文獻有少數報道。在肝癌組織內前S1和前S2抗原的檢出率為20%左右,略比HBsAg檢出率高。在癌周肝組織前S1和前S2抗原的檢出率為60%左右,這個和HBsAg的檢出率基本相似。在絕大多數HBsAg陽性的病例前S1和前S2抗原亦陽性,而在部分前S1和前S2陽性病例,HBsAg卻呈陰性反應。因為在基因構成上,前S1包括前S2和HBsAg,前S2包括HBsAg的部分,故前S1和前S2的表達要比HB-sAg強。用免疫組化方法染色,前S1和前S2陽性物質呈棕紅色呈均勻細顆粒狀,主要位於癌細胞及肝細胞的胞漿內,有些病例則和/或位於胞膜上及核內。陽性物質反應的強弱和前S1或前S2抗原的含量有關。一般來說,前S1或前S2陽性反應強度和陽性細胞檢出率,癌周肝組織比癌組織強。這一規律和HBsAg相同。前S1或前S2陽性物質在細胞內的分佈情況及其陽性細胞分佈狀態和HBsAg的基本相似。目前對前S1或前S2抗原在肝癌發病中的作用尚不完全清楚。有人研究證明,在人肝細胞膜上存在兩種不同的受體,一種受體可以直接與前S1蛋白結合;另一種受體通過多聚人血清白蛋白(PHSA)與前S2蛋白結合。所以HBV通過PHSA介質結合在肝細胞上,從而形成靶抗原,通過免疫反應引起肝細胞的損傷,進而可能發生肝細胞的增生,不典型增生,最終導致癌變。

  3.肝癌及癌周肝組織內HBcAg(HBeAg)的定位及分佈到目前為止,在肝癌細胞內發現有HBcAg只有少數報道。所有的報道,HBcAg的檢出率都不太高,大多在10%~20%左右。HBcAg和HBeAg在肝癌及癌周肝組織內不易檢出或檢出率較低的原因,可能是由於HBcAg 和抗HBc常以免疫複合物的形式存在於胞核內,HBcAg被封閉之故;亦可能由於HBcAg基因和宿主基因進行了整合,使HBcAg不再表達出來。HBcAg和HBeAg經常並存,因此HBeAg亦經常不易單獨檢出。HBcAg或HBeAg陽性物質呈均勻細顆粒狀分佈於胞核內,少數見於核仁內。位於核內常呈圓形或卵圓形,圍繞核仁佔據整個核或佔據核的大部分。少數病例HBcAg陽性物質位於胞漿內或胞膜上,有的病例核、膜及漿內同時陽性。HBcAg陽性細胞的分佈與HBsAg的分佈相似。

  關於肝癌的免疫學方面的研究,血清學方面的研究較多,組織學研究的較少。大量的流行病學和臨床學方面的資料表明,肝癌患者血清中抗-HBc明顯高於對照組,其陽性率高達70%~95%。用免疫組化技術在肝癌及癌旁肝組織內亦發現有抗-HBc的存在。有人證實抗-HBc為IgG,這種IgG經常和HBcAg以複合物的形式存在於細胞核內,少數也見於胞漿及胞膜上。並證實,IgG只見於含有HBcAg的胞核內,而無核內HBcAg,就無抗-HBc存在。因此,如果能測出IgG(抗-HBc),也就間接地證實了HBcAg的存在。IgG(抗-HBc)陽性呈圓形或卵圓形位於核內或以包涵體位於胞漿內。IgG陽性細胞的分佈狀態和HBcAg的分佈相同。IgG(抗-HBc)在肝癌發病中起何作用,目前尚不清楚,有人認為IgG和HBcAg形成免疫複合的,由於免疫反應,在慢性活動性肝炎發病中和肝硬變形成中起重要作用,而慢活肝和肝硬變又是肝癌發生的重要環節。HBcAg和抗-HBc形成的免疫複合物是否為癌變的始動因素,還有待進一步研究。

  4.肝癌及癌周肝組織內HBxAg的定位及分佈近年來,對HBV分子生物學研究發現了HBV另一種抗原,即HBxAg。HBxAg和肝癌發生的關係密切,已引起人們廣泛的重視。目前,國內外已有少數文獻報道關於HBxAg和肝癌發病的關係的研究。在人原發性肝癌組織內HBxAg的檢出率大約為60%~80%,這明顯高於HBsAg的檢出率。在癌周肝組織內HBxAg陽性檢出率在70%~80%,這和HBsAg的檢出率基本相似。用PAP或ABC方法檢測HBxAg,其陽性物質呈棕褐色均勻細顆粒狀,主要位於癌細胞和肝細胞胞漿內,部分病例除胞漿陽性外,胞膜或核亦陽性(約20%),單獨膜型或核型少見。不同病例HBxAg陽性物質的分佈及陽性反應強度是不同的,就是同一病例不同部位,其結果也不盡相同。一般來說,癌周肝組織內HBxAg陽性檢出率及陽性反應強度比癌組織內高。其反應強弱與HBxAg含量多少有關。HBxAg陽性細胞分佈與HBsAg陽性細胞分佈相似,亦分為散在型,局灶型和瀰漫型。在癌周硬變組織內,HBxAg陽性細胞有時圍繞小血管分佈。有的則沿著纖維膈分佈。在HBxAg陽性病例,有24%在癌組織內伴有HBsAg和/或HBcAg,有72%在癌周肝組織內伴有HBsAg和/或HBcAg。HBx-Ag在肝癌發病中的作用,目前尚不完全清楚。有人報道在肝癌患者血清中含有較高的抗-HBx,其檢出率高達85%。Miyaki等(1986)發現在所檢查的原發性肝細胞癌組織中都存在和HBV的X基因相同的DNA序列。有些作者認為,宿主細胞DNA和HBv DNA的整合是通過X基因區特殊的重組來完成的,其翻譯產物-HBx蛋白(HBxAg)對癌基因具有反式激活作用,而引起細胞癌變。最近有人通過HBV的X基因在轉基因小鼠中誘發肝癌的動物實驗證明,HBx蛋白能夠改變宿主基因的表達,並導致肝細胞癌的發生。因此,有些作者認為HBxAg在肝癌發生中具有重要作用,並認為HBV可能具有直接致癌作用。

(四)肝膽管癌及癌周肝組織HBV抗原的分佈

  在原發性肝癌中,最常見的是肝細胞肝癌,而肝內膽管細胞癌比較少見,在中國大約為10%。長期以來,人們對肝內膽管細胞癌的病因及發病機理研究甚少,認識不清。早年候寶璋曾報道,膽內提管細胞癌的發生與中華分枝睾吸蟲感染有關。最近有文獻報道,在肝內膽管細胞癌及其癌周肝組織內檢測出HBv 5中抗原(HBsAg、pre-S1、pre-S2、HBxAg和HBcAg),而且檢出的陽性率很高。王文亮等報道(1993),在20例肝內膽管細胞癌中,HBxAg陽性檢出率為75%,pre-S1和S2各為40%,HBsAg為10%;在19例癌周肝組織中,HBxAg陽性檢出率為84%,pre-S1和S2各為47%,HBsAg t HbcAg分別為32%。在20例肝內膽管細胞癌的病例中有17例(85%)有不同HBV抗原的表達,其中HBxAg陽性檢出率為80%。這一結果表明,肝內膽管細胞癌的發生與HBV感染有密切關係。HBV5種抗原在肝內膽管細胞癌及其癌周肝組織內的陽性反應及陽性細胞分佈狀態與肝細胞肝癌相同。肝內膽管細胞癌的發病過程可能與肝細胞肝癌不完全相同。肝細胞肝癌80%伴有肝硬變,特別是大結節 型肝硬變。一般認為大多數肝細胞肝癌是由於HBV感染→慢性肝炎→肝硬變→肝癌。而肝內膽管細胞癌很少伴有肝硬變,它的發生過程主要不是通過肝硬變這一重要環節,而是由慢性肝炎,肝細胞不典型增生或中間型細胞演變為肝癌。HBV是否有直接致癌的作用尚有等進一步研究。

(五)肝細胞癌中的HBV的分子生物學

  近10年來,國內外對原發性肝細胞癌中乙型肝炎病毒DNA的存在,分佈及意義進行了廣泛的研究,並取得了可喜的成果。用southern blot 分子雜交技術及原位分子雜交技術,在肝癌患者血清中和肝癌組織中檢測HBV-DNA的分佈狀態。用HBV-DHA基因或其亞基因標記同位素(32P、35S等)及生物素地高辛等作為探針和肝癌及癌旁肝組織中的DNA進行雜交,通過放射自顯影法檢測HBV-DNA存在狀態(是整合或遊離);原位分子雜交經過染色反應觀察細胞內HBV-DNA的定位和分佈狀態。有人用southern blot方法檢測肝癌病人血清中HBV-DNA的情況,只有少數病例血清中有微量的HBV-DNA,則慢性乙型肝炎患者血清卻多為陽性,提示在HBsAg陽性肝癌病人血清中很少或沒有可測出的HBV-DNA。目前,國內外已有不少文獻報道,在肝癌組織中有整合的HBV-DNA。例如,Shafritz等(1981)檢測了20例來自南非的肝癌患者,有15例HBV-DNA整合人宿主細胞DNA中,其中12例HBsAg陽性,3例HBsAg陰性而抗-HBs陽性。Tiollais(1981)檢查了15例來自歐洲的肝癌標本,HBsAg或抗-HBs陽性病例,檢查結果HBV-DNA均以整合形式存在。他們還觀察了32例HBsAg陽性的肝癌病人,結果證明在所有肝癌組織中均有HBV-DNA。國內大多數報道在肝癌組織中HBV-DNA檢出率為60%~80%。上述結果表明,人原發性肝細胞癌的發生和HBV感染有極為密切關係。

(六)肝癌發生中HBV分子遺傳學及免疫機理

  免疫病理學及分子生物學的研究表明,HBV不僅有間接致肝癌作用,而且還可能有直接致癌作用。HBV致癌作用的分子機理目前集中對於HBV的分子遺傳學和分子免疫學的研究。在原發性肝細胞癌發生中,HBV致癌作用可能有兩個模式:一是病毒的癌基因模式,就是表達病毒的癌基因(HBV-DNA);另一個是細胞癌基因模式,在肝細胞癌變過程中,細胞癌基因可能發生啟動子插入,染色體異常(缺失、重複、易位)及點突變等。研究證明,機體感染HBV后,HBV將其本身的基因摻入到肝細胞核內,和宿主細胞基因發生整合,從而使正常的肝細胞轉變為癌細胞。這需要經過一個複雜的演變過程。在肝癌的HBV-DNA整合部位,常發生染色體缺失、重複或易位。Slagle等(1990)研究發現,有44%的肝細胞癌病人發生染色體的丟失,而17P的丟失常包括抑癌基因P53的丟失,這可能是肝細胞癌發生的原因。Blum(1985)認為在HBV-DNA整合位點附近宿主細胞基因有重排現象。Tiollais等認為病毒DNA整合人宿主細胞DNA或與DNA發生重排,產生HBV激活的基因或激活細胞的原癌基因,進而導致細胞的轉化,最終發生肝癌。有人通過實驗研究證明病毒插入到細胞原癌基因附近,作為一種誘變劑,可能直接參与肝細胞癌的發生。Seifter等(1990)在體外進行X基因的轉化實驗,將HBV-DNA或X基因序列連在SV40早期啟動子的加強子上,用以轉化傳代鼠肝細胞及傳代鼠纖維母細胞,轉染成功的能穩定複製HBV的肝細胞表現出惡性生長的特徵,將其接種裸鼠,顯示出致癌性,並激活細胞原癌基因c-fos過量表達。這提示,HBV-DNA含有致癌基因序列,可以促進細胞向惡性轉化。HBV基因組中編碼加強子和X蛋白的鹼基序列也有某些致癌活性。儘管如此,到目前為止,HBV致癌的分子機理尚不完全清楚,有待進一步研究。

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